Über die microRNA und mRNA-Expressionsmuster beim Krankheitsbild des akut-auf-chronischen-Leberversagens

Abstract

Das akut-auf-chronische Leberversagen [Acute-on-chronic liver failure (ACLF)] ist ein Krankheitsbild, welches Patienten mit einer chronischen Lebererkrankung betrifft und erst kürzlich als eigenständige Krankheitsentität definiert wurde. Die in Europa verbreitete Definition des ACLF nach der European Association for the Study of the Liver – Chronic Liver Failure (EASL-CLIF) beruht auf einer prospektiven Patientenstudie, welche insgesamt 1 343 Patienten einschloss. Diese Definition umfasst drei Komponenten: akute Dekompensation der Leberzirrhose, Ein- oder Mehrorganversagen und eine 28-Tage Mortalität > 15%. Nach dieser wegweisenden Publikation aus dem Jahre 2013 haben neuere Arbeiten weitere Charakteristika des ACLF ergründet. So entwickelt sich das ACLF häufig in engem zeitlichen Zusammenhang mit einem proinflammatorischen auslösenden Ereignis (z.B. alkoholische Hepatitis oder bakterielle Infektion), und es ist mit einer fulminanten systemischen Inflammation assoziiert [9,123]. Die Pathophysiologie des ACLF ist jedoch nur unvollständig verstanden, so kann beispielweise bei bis zu 44% der ACLF-Patienten kein auslösendes Ereignis identifiziert werden [99]. Ebenso sind die genaue Pathophysiologie der systemischen Inflammation und der Schädigungsmechanismus der extrahepatischen Organe nicht vollständig geklärt [10]. Aufgrund der hohen Dynamik des Krankheitsbildes und der Ermangelung kausaler Therapien ist das ACLF bis heute eine große diagnostische und therapeutische Herausforderung mit einer schlechten Prognose. Diese Arbeit soll das microRNA- und mRNA-Expressionsmuster beim ACLF untersuchen. Hierdurch sollen die intrahepatischen biologischen Prozesse des ACLF besser verstanden werden und die Grundlage für kausale Therapien gelegt werden. Darüber hinaus soll zur Verbesserung der Diagnose des ACLF ein Biomarker identifiziert werden, welcher spezifisch für das Krankheitsbild ist. In unserer Arbeitsgruppe war ein transgenes ACLF-Mausmodell etabliert worden, um das Zusammenwirken des akuten und chronischen Leberschadens auf mRNA- und microRNA- Ebene zu untersuchen. An Lebergewebe der ACLF Mäuse [Abcb4-Defizienz + LPS (intraperitoneale Lipopolysacharid-Injektion)] wurden eine mRNA-Sequenzierung und microRNA-PCR-Arrays durchgeführt. Die Ergebnisse der mRNA-Sequenzierung wurden im Hinblick auf die zugrundeliegenden biologischen Prozesse ausgewertet. Als Kontrollgruppen dienten lebergesunde Wildtyp-Mäuse [WT + NaCl (intraperitoneale Natriumchlorid- Injektion)], Wildtyp-Mäuse mit akuten Leberschaden (WT + LPS) und Mäuse mit chronischem Leberschaden (Abcb4-Defizienz + NaCl). Im Zuge der microRNA-PCR-Arrays wurden sieben microRNAs identifiziert, welche sich als potentielle Biomarker zur frühzeitigen Diagnose des 2 ACLF eignen. Diese sieben microRNAs wurden anschließend in humanen Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose, Leberzirrhose mit akuter bakterieller Infektion und ACLF (gesicherte Diagnose nach EASL-CLIF Definition) bestimmt. Als Kontrollgruppe dienten Serumproben von gesunde Probanden. Im Rahmen der Tierversuche konnten 145 differentiell exprimierte Gene [Differentially expressed Genes (DEG)] identifiziert werden, welche beim ACLF intrahepatisch verändert exprimiert werden. Diese Gene sind vor allem an inflammatorischen Immunprozessen beteiligt. Zudem konnten sieben microRNAs identifiziert werden, die ebenso an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind. Im Zuge der Translation der Ergebnisse der microRNA-Analysen von Maus zu Mensch konnten die Ergebnisse für miR-148a-3p bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Serumspiegel von mir-148a-3p bei Patienten mit ACLF erhöht sind. Ferner korrelierten die Serumspiegel von mir-148a-3p positiv mit dem ACLF-Grad. Auch konnte gezeigt werden, dass bereits bei Patienten mit Leberzirrhose und akuter bakterieller Infektion die Serumspiegel von mir-148a-3p erhöht sind. Zudem war die Erhöhung der Serumspiegel von mir-148a-3p unabhängig davon, ob das ACLF durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wurde oder nicht. Somit scheint diese microRNA ACLF unabhängig von seinem Auslöser anzuzeigen. Die Ergebnisse der Tierversuche und der Patientenstudien legen nahe, dass die im Serum zirkulierende microRNA mir-148a-3p als robuster diagnostischer Marker für ACLF dienen kann. Zirkulierende mir-148a-3p vermag das Potential zu haben, die Entwicklung und Dynamik des ACLF nicht-invasiv zu erfassen, weshalb ihr diagnostisches Potential in weiteren Patientenstudien validiert werden sollte. Zudem konnte in den Tierversuchen ein intrahepatisches Genexpressionsmuster, bestehend aus 145 Genen, identifiziert werden, welches das ACLF vom gesunden Normalzustand, dem akuten und dem chronischen Leberversagen unterscheidet und somit Teil der molekularen Grundlagen des ACLF zu sein scheint. In unserer Arbeitsgruppe wird aktuell an der Validierung der Zielgene von mir-148a- 3p in primären Hepatozyten unter ACLF-Bedingungen gearbeitet, um weitere diagnostische und therapeutische Möglichkeiten aufzuzeigen.

2 Summary Acute-on-chronic liver failure (ACLF) is a condition that affects patients with chronic liver disease and has recently been defined as an independent disease entity. The definition of ACLF used in Europe according to the European Association for the Study of the Liver - Chronic Liver Failure (EASL-CLIF) criteria is based on a prospective patient study that included a total of 1343 patients. This definition includes three components: acute decompensation of liver cirrhosis, single or multiple organ failure and a 28-day mortality rate above 15%. Following this landmark publication in 2013, more recent publications have explored further characteristics of ACLF. For example, ACLF often develops in close temporal relation to a proinflammatory initiating event (e.g. alcoholic hepatitis or bacterial infection) and is associated with fulminant systemic inflammation. However, the pathophysiology of ACLF is incompletely understood. In up to 50% of ACLF patients, no precipitating event can be identified. Similarly, the exact pathophysiology of the systemic inflammation and the mechanism of damage to extrahepatic organs has got to be defined. Due to the highly dynamic nature of the clinical picture and the lack of causal therapies, ACLF remains a major diagnostic and therapeutic challenge with poor prognosis. This thesis aimed to investigate microRNA and mRNA expression patterns in ACLF. This should provide a better understanding of the intrahepatic biological processes of ACLF and open avenues for better therapies. Furthermore, to improve diagnosis, a novel biomarker for ACLF should be identified. In our research group, a transgenic ACLF mouse model was established to study the interaction of acute and chronic liver damage at the mRNA and microRNA level. Liver tissue from ACLF mice [Abcb4-deficiency + LPS (Lipopolysaccharide)] were subjected to mRNA sequencing and microRNA PCR arrays. The results of mRNA sequencing were evaluated in terms of the underlying biological processes. Liver-healthy mice [Wild-type (WT) + NaCl], mice with acute liver damage (WT + LPS) and mice with chronic liver damage (Abcb4-deficiency + NaCl) served as control groups. In microRNA-PCR arrays, seven microRNAs were identified that could represent potential biomarkers for ACLF. These seven microRNAs were then measured in human serum samples from patients with cirrhosis, cirrhosis plus acute bacterial infection, and ACLF (confirmed diagnosis according to EASL-CLIF criteria). Serum samples from healthy volunteers served as controls. 4 In the animal experiments, 145 Differentially expressed Genes (DEG) were identified, which are expressed differentially in ACLF. These genes are mainly involved in inflammatory mechanisms. The identified microRNAs were also previously described to play a role in inflammation. Translating the results of the microRNA analyses from mouse to human, the findings for miR-148a-3p could be confirmed. It could be demonstrated that serum levels of mir-148a-3p are increased in patients with ACLF. Furthermore, serum levels of mir-148a-3p correlated positively with ACLF grade. Serum levels of mir-148a-3p were also elevated in patients with cirrhosis and acute bacterial infection. Moreover, the increase in serum levels of mir-148a-3p was independent of whether ACLF was triggered by bacterial infection or not. Thus, they seem to indicate ACLF regardless of its trigger. The results of the animal and patient studies suggest that circulating mir-148a-3p in serum can serve as a diagnostic marker for ACLF. Circulating mir-148a-3p appears to have the potential to detect the development and dynamics of ACLF non-invasively, so its diagnostic potential should be validated in further patient studies. In the animal studies an intrahepatic gene expression pattern consisting of 145 genes could be identified, which distinguishes ACLF from the healthy normal state, acute and chronic liver failure, and thus seems to be part of the molecular signature of ACLF. Our research group is currently working on the experimental validation of the target genes of mir-148a-3p in primary hepatocytes under ACLF conditions to develop further diagnostic and therapeutic options.