Functional and morphological adaptations in tafazzin-deficient pancreatic islets in the context of Barth syndrome

Abstract

Das Barth Syndrom (BTHS) ist eine X-chromosomale Multisystem Erkrankung, die durch Mutationen in dem Gen verursacht wird, das für das mitochondriale Enzym Tafazzin (Taz) kodiert. Die Transacylase Tafazzin katalysiert den finalen Schritt in der Biosynthese von Cardiolipin (CL) und beeinflusst dadurch entscheidend die Phospholipid-Zusammensetzung in der inneren Mitochondrienmembran. BTHS-Patienten leiden unter einer Vielzahl schwer-wiegender Symptome, darunter Herzversagen, Muskelschwäche und systemischer Stoffwechselstörungen, einschließlich Hypoglykämie. Die Rolle von dysfunktionaler CL-Zusammensetzung in pankreatischen Inseln ist bisher weitgehend unerforscht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein shRNA-basiertes, Doxycyclin-induzierbares Tafazzin-Knockdown (Taz-KD) Maus Modell, bekannt als shTaz, verwendet, um die Eigenschaften und Funktionalität von Pankreasinseln im Zusammenhang mit BTHS zu untersuchen. Nach einer anfänglichen Charakterisierung des Taz-KD Modells mittels qPCR-Messung des Taz Gens und Lipidomik-Analyse bei Taz-KD Pankreasinseln, wurden die 20 Wochen alten Taz-KD Mäuse systemisch über das Körpergewicht und mithilfe eines Glukose-Toleranz-Tests mit Wildtyp (WT) Wurfgeschwister Mäusen verglichen. Anschließend wurden Pankreasschnitte mittels Immunfärbung zunächst nach der zellulären Zusammensetzung der Pankreasinseln (α-, β- oder δ-Zellen) und dann nach Apoptose- oder Proliferation-Markern untersucht. Danach wurde eine umfassende biochemische und funktionelle Analyse der isolierten Taz-KD Pankreasinseln durchgeführt. Außerdem wurde der Einfluss von Redox Veränderungen über Redox-Histologie und Western Blot bei Taz-KD Pankreasinseln analysiert. Da BTHS primär eine Schädigung der Mitochondrien verursacht, wurde die Funktion und Morphologie der Mitochondrien über einen Seahorse XFe96 Analysator und über konfokale Mikroskopie bei isolierten intakten und vereinzelten Taz-KD pankreatischen Inseln untersucht. Des Weiteren wurde die Zusammensetzung des RNA- und Lipid-Profils mittels RNA-Sequenzierung und Lipidomik-Analyse von WT und Taz-KD Pankreasinseln verglichen. Abschließend wurden ein neues Taz-KD in vitro Modell mit einer Woche Doxycyclin Gabe im Kulturmedium etabliert und mechanistisch untersucht. Diese Ergebnisse wurden mit den zuvor gewonnenen Daten der funktionellen Analyse von Taz-KD Pankreasinseln bei lebenslanger Doxycyclin Gabe im Futter verglichen, was ein umfassendes Verständnis der Biologie der Pankreasinseln bei der BTHS-Entwicklung ermöglicht. In den Ergebnissen wurde zunächst die Effizienz des Taz-KD mit ca. 65% für Pankreasinseln und ca. 85% bei Herzen festgestellt. Trotz abgeschwächter Effizienz des Taz-KD bei Pankreasinseln kam es zu einer Abnahme der CL-Konzentration sowie einer geänderten CL-Spezies-Zusammensetzung. Zusätzlich, wurden ebenfalls andere Phospholipidklassen, insbesondere Phosphatidyl-ethanolamin, -cholin, -glycerol durch den Taz-KD signifikant beeinflusst. Die Taz-KD Mäuse zeigten ein verringertes Körpergewicht und eine verbesserte Glukose-Toleranz mit unveränderten Insulin- und Glukagon-Plasma-Werten gegenüber den WT-Kontrollen. Taz-KD Pankreasinseln zeigten eine vermehrte Anzahl an α-Zellen verbunden mit einer erhöhten Glukagon-Sekretion und unveränderter Insulin-Sekretion. Weitere funktionelle Experimente ergaben einen beschleunigten, zytosolischen Ca2+-Einstrom, eine unveränderte ATP-Produktion und eine erhöhte Glukose-Aufnahme der Taz-KD Pankreasinseln. Eine mitochondriale Redox-Analyse ergab einen leicht reduzierten in vivo sowie einen geringfügig oxidierten ex vivo Redox-Status, verbunden mit einer gesteigerten NOX4 Aktivität und einer erhöhten Menge an Prx3 bei Taz-KD Pankreasinseln. Die Mitochondrien von Taz-KD Pankreasinseln hatten ein vergrößertes Volumen und einen leicht erhöhten Sauerstoffverbrauch bei niedrigen Glukosemengen. Des Weiteren ergab eine Reactome Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten, dass mehrere Gene die an der post-translationalen Modifikation der O-Glykosylierung beteiligt sind, in den Taz-KD Pankreas-inseln erhöht waren. Dieser Anstieg konnte auf Proteinebene durch Western Blot und Immunfärbung bestätigt werden. Abschließend wurde beim Taz-KD in vitro Modell im Vergleich zu gleich behandelten Kontrollen ebenfalls eine Abnahme um 65% der Taz RNA und ein geändertes CL-Profil beobachtet. Außerdem konnte eine verminderte ATP-Menge und Insulin Sekretion beim in vitro Taz-KD Modell gemessen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Funktionalität der Taz-KD Pankreasinseln in vivo erhalten bleibt. Dies wird über verschiedene kompensatorische Wege einschließlich vergrößertes Mitochondrien-Volumen, erhöhter Glukoseaufnahme und amplifizierter O-Glykosylierung gewährleistet. Außerdem könnte die erhöhte Menge an α-Zellen und die gesteigerte Glukagon-Sekretion, die Insulin-Sekretion über parakrine Signalwirkung positiv beeinflussen. Diese adaptiven Mechanismen sind vielversprechende Ansatzpunkte für die Behandlung von Pankreasinseln bei metabolischen Defekten. Im Gegensatz dazu hat das Taz-KD in vitro Modell gezeigt, dass eine Reduktion der Taz RNA bei ausbleibenden adaptiven Mechanismen, eine direkte Störung der Pankreasinseln zur Folge hat. Dies verdeutlicht die wichtige Rolle von CL für die Funktion von Pankreasinseln.

Barth syndrome (BTHS) is an X-linked multisystem disorder caused by mutations in the gene encoding the mitochondrial enzyme tafazzin (Taz). The transacylase tafazzin catalyses the final step in the biosynthesis of cardiolipin (CL), thereby decisively influencing the phospholipid composition in the inner mitochondrial membrane. BTHS patients suffer from a variety of severe symptoms, including heart failure, muscle weakness, and systemic metabolic disturbances, including hypoglycemia. The role of dysfunctional CL composition in pancreatic islets is mostly unexplored. In this thesis, a shRNA-based doxycycline-inducible tafazzin knockdown (Taz-KD) mouse model, known as shTaz, was used to investigate the properties and functionality of pancreatic islets in the context of BTHS. After initial characterisation of the Taz-KD model using qPCR measurements of the Taz gene and lipidomics analysis of Taz-KD pancreatic islets, 20-week-old Taz-KD mice were compared systemically by body weight and using a glucose tolerance test with wildtype (WT) littermate mice. Subsequently, pancreas tissue slices were analysed, first for the cellular composition of the pancreatic islets (α-, β- or δ-cells) and then for apoptosis or proliferation markers. Subsequently, comprehensive biochemical and functional analyses of the isolated Taz-KD pancreatic islets were performed. In addition, the influence of redox changes on Taz-KD pancreatic islets was analysed using redox histology and western blotting. Since BTHS primarily causes mitochondrial damage, the function and morphology of mitochondria were examined using a Seahorse XFe96 analyser and confocal microscopy in isolated intact and dispersed Taz-KD pancreatic islets. Furthermore, the RNA and lipid profiles of WT and Taz-KD pancreatic islets were compared by RNA sequencing and lipidomics analysis. Finally, a new Taz-KD in vitro model with one week of doxycycline administration into the culture medium of isolated islets was established and mechanistically investigated. These results were compared with the earlier obtained data from the functional analyses of the Taz-KD pancreatic islets of mice receiving a lifelong doxycycline diet. Together these results provide a comprehensive understanding of pancreatic islet physiology during BTHS development. The efficiency of doxycycline-induced Taz-KD was approximately 65% for pancreatic islets and 85% for hearts. Despite the attenuated efficiency of Taz-KD in pancreatic islets, it still resulted in a decreased concentration of CL and a significantly altered CL species composition. Taz-KD in pancreatic islets also significantly affected other phospholipid classes, specifically phosphatidyl-ethanolamine, -choline, and -glycerol. The Taz-KD mice displayed reduced body weight and improved glucose tolerance with unchanged plasma insulin and glucagon levels compared to WT controls. Taz-KD pancreatic islets had more α-cells, which was associated with enhanced glucagon but unchanged insulin secretion. Further functional experiments revealed a faster cytosolic Ca2+ influx upon glucose stimulation, an unchanged ATP production, and an increased glucose uptake of Taz-KD compared to WT pancreatic islets. Mitochondrial redox analysis revealed a slightly reduced in vivo and an oxidised ex vivo redox state, which was connected with increased NOX4 activity and a higher amount of Prx3 in Taz-KD compared to WT pancreatic islets. The mitochondria of Taz-KD pancreatic islets had a larger volume than control islets and a slightly increased oxygen consumption rate at low glucose levels. Moreover, Reactome analysis of RNA sequencing data revealed that several genes involved in the post-translational modification of O-glycosylation were increased in Taz-KD pancreatic islets. This increase was confirmed at the protein level by western blotting and immunostaining. Finally, using the Taz-KD in vitro model, a 65% decrease in Taz RNA and an altered CL profile were observed, when compared to doxycycline-cultured controls. Additionally, decreased ATP levels and impaired insulin secretion were measured in Taz-KD pancreatic islets from the in vitro model. The results of this thesis show that the functionality of Taz-KD pancreatic islets is maintained in vivo. This is ensured via several compensatory mechanisms, including enhanced mitochondrial volume, increased glucose uptake, and amplified O-glycosylation. In addition, the increased number of α-cells and the higher glucagon secretion could positively influence insulin secretion via paracrine signalling. These adaptive mechanisms are promising targets for the treatment of pancreatic islets in metabolic disorders. On the other hand, the Taz-KD in vitro model has shown that a reduction of Taz RNA in the absence of compensatory mechanisms results in a direct defect of pancreatic islets. This highlights the vital role of CL remodelling in pancreatic islet functionality.