Etablierung eines quantitativen Verfahrens zur Analyse der zellulären Zusammensetzung von Co-Kultur-Sphäroiden auf Basis von Kryoschnitten

Abstract

Die Versorgung von kritisch großen Knochendefekten ist immer noch eine der schwierigen Aufgaben in der Traumatologie. Nach wie vor stellen autologe Knochentransplantate den Goldstandard dar. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit autologer Knochentransplantate ist es ein Ziel des Tissue Engineering, alternative Knochenersatzmaterialien zu entwickeln. Grundsätzlich hängt der Erfolg der Versorgung mit Knochenersatzmaterialien von einer ausreichenden und schnellen Durchblutung ab, um eine adäquate Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie den Abtransport von Abfallprodukten zu gewährleisten. Ein vielversprechender Ansatz dabei sind sogenannte Sphäroide, die schon seit Jahrzehnten in der Tumorforschung verwendet werden. Diese 3D-Zellkonstrukte stellen eine Art „Mini-Gewebe“ dar, an dem angiogenetische Prozesse erforscht werden können und die das Potential besitzen, im Rahmen des Tissue Engineering von Knochenersatzmaterialien eingesetzt zu werden. Aufgrund der intensiveren Zell-Zell-Kontakte simulieren sie die in vivo-Situation besser als 2D-Kulturen. Eine umfassende und grundlegende Charakterisierung der Sphäroide stellt eine wichtige Voraussetzung für mögliche zukünftige klinische Anwendungen dar. Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung der zellulären Zusammensetzung in Co-Kultur-Sphäroiden anhand der Auswertung von Kryoschnitten, wobei die einzelnen Zelltypen vorab mit Lebendfluoreszenzfarbstoffen markiert wurden. Hierdurch konnte zum einen die Verteilung der unterschiedlichen Zelltypen innerhalb des Sphäroids zu unterschiedlichen Zeitpunkten beobachtet werden sowie die Quantifizierung der zellulären Zusammensetzung. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob es über einen bestimmten Zeitraum zu Reorganisationen im Sphäroid kommt. Es wurden Co-Kultur-Sphäroide bestehend aus den drei Zelltypen humane dermale mikrovaskuläre endotheliale Zellen (HDMEC), normale humane dermale Fibroblasten (NHDF) und humane Osteoblasten (HOB) mittels Liquid-Overlay-Technik (LOT) hergestellt. Zur Diskriminierung der drei Zelltypen wurden die drei Lebendfluoreszenzfarbstoffe CMFDA, PKH26 und CellBrite benutzt. Es wurden Sphäroide unterschiedlicher prozentualer Zusammensetzung, die jeweils aus 10.000 bzw. 50.000 Zellen bestanden, hergestellt (Gruppe I bis III). Die Sphäroide wurden anschließend für einen Tag, drei Tage oder sechs Tage inkubiert. Danach wurden sie eingefroren und Kryoschnitte angefertigt. Zum einen wurde die prozentuale Verteilung der Zellflächenanteile im Sphäroid betrachtet, zum anderen die Veränderung von Durchmesser sowie absoluter Zellfläche über die Zeit. Weiterhin wurden qualitative Beobachtungen bezüglich der Zellverteilung und Besonderheiten in der Zellorganisation innerhalb des Sphäroids durchgeführt. Die gewonnenen Daten zur Bestimmung der Zellanteile wurden nach erfolgreicher Dissoziation der Sphäroide in Einzelzellen zusätzlich durch FACSTM-Analysen (fluorescence activated cell sorting) als alternative Methode überprüft. Durch Vermessung der Zellflächenanteile zeigte sich, dass die prozentualen Verteilungen der Zellen von Tag 1 bis Tag 6 relativ stabil blieben. Sowohl die Sphäroiddurchmesser als auch die absolute Sphäroidfläche nahmen über die Zeit ab. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Durchmessern vitaler Sphäroide und den Durchmessern der Kryoschnitte. Bei der FACS-Analyse von dissoziierten Sphäroiden war eine deutliche Abnahme der Zahl der HDMEC bei gleichzeitiger Zunahme der Zahl der NHDF mit zunehmendem Sphäroidalter zu erkennen. Weiterhin zeigten sich für bestimmte Zelltypen charakteristische Zellverteilungen im Sphäroid. So lagen die HDMEC sowohl in der Gruppe I als auch II flächig über das Sphäroid verteilt mit randständig etwas kompakterer Lage. Mit zunehmendem Sphäroidalter kam es bei den HDMEC zu einer leichten Zunahme zellfreier Areale. Die NHDF und die HOB zeigten in den Gruppen I und II eine ähnliche Verteilung. An Tag 1 lagen die Zellen am Rand dicht gepackt mit deutlich mehr zellfreien Bereichen zur Mitte des Sphäroids. In Gruppe III zeigten die HOB über die gesamte Zeit eine homogene Verteilung. Die HDMEC und NHDF zeigten ein ähnliches Verteilungsmuster wie in den Gruppen I und II. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Lebendfluoreszenzfärbung einige Vorteile aufweist. Die Färbung ist beim Betrachten unter dem Fluoreszenzmikroskop stabil und beeinträchtigt nicht die Vitalität der Zellen. Außerdem ist die Diskriminierung unterschiedlicher Zelltypen problemlos möglich. Auch das Anfertigen von Kryoschnitten ist wenig zeitaufwändig und relativ einfach durchführbar. Jedoch ist die Methode invasiv und hat Limitierungen. Die teilweise hohen Standardabweichungen bei der Bestimmung der Zellflächenanteile könnten durch die leicht unterschiedliche Dicke der Kryoschnitte erklärt werden. Weiterhin zeigten manche Sphäroide ein zellfreies Zentrum. Dies könnte durch Verlust von Zellen beim Schneidevorgang erklärbar sein. Daher wäre das Testen einer weiteren Schneidemethode z.B. Paraffinschnitte zum Vergleich sinnvoll. Die FACSTM-Analyse von dissoziierten Sphäroiden stellt eine alternative, aber auch synergistische Methode zur Analyse der Zellflächenanteile dar. Die Dissoziationsbedingungen müssen jedoch optimal gewählt werden, da zu stringente Bedingungen die Zellvitalität negativ beeinflussen können. Zusammenfassend stellt die Sphäroidforschung ein vielversprechendes Forschungsgebiet beispielsweise im Tissue Engineering und der Angiogeneseforschung dar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine reproduzierbare Methode zu entwickeln, um die zellulären Vorgänge im Sphäroid darzustellen und damit zur weiteren Erforschung der Sphäroide beizutragen.

The treatment of critical sized defects of bones is still one of the difficult tasks in traumatology. Autologous bone grafts still represent the gold standard. Due to the limited availability of autologous bone grafts, one goal of tissue engineering is to develop alternative bone graft substitutes. Basically, the success of tissue engineered bone grafts depends on sufficient and rapid blood flow to ensure adequate supply of oxygen and nutrients as well as removal of metabolic end products. So-called spheroids, which have been used in tumor research for decades, are a promising approach in this regard. These 3D cell constructs represent a kind of "mini-tissue" on which angiogenic processes can be studied and which have the potential to be used in the tissue engineering of bone replacement materials. Due to the more intensive cell-cell contacts, they simulate the in vivo situation better than 2D cultures. A comprehensive and fundamental characterization of the spheroids represents an important prerequisite for possible future clinical applications. The aim of this medical doctoral thesis was to establish a method for the quantitative determination of cellular composition in co-culture spheroids based on the evaluation of cryosections, where mono-cultures of the used cell types were stained with fluorescent dyes for living cell prior to the generation of spheroids. This allowed, on the one hand, the distribution of the different cell types within the spheroid at different time points to be observed as well as the quantification of the cellular composition. Second, to determine whether reorganizations occur in the spheroid over a period of time. Co-culture spheroids consisting of the three cell types, human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC), normal human dermal fibroblasts (NHDF), and human osteoblasts (HOB) were prepared by liquid overlay technique (LOT). Three live fluorescent dyes, CMFDA, PKH26 and CellBrite, were used to discriminate the three cell types. Spheroids of different cellular compositions, each consisting of 10,000 or 50,000 cells, were prepared (group I to III). The spheroids were then incubated for one day, three days, or six days. They were then frozen and cryosections were made. On the one hand, the percentage distribution of cell area fractions in the spheroid was observed, and on the other hand, the change in diameter as well as absolute cell area over time. Furthermore, qualitative observations were made regarding cell distribution and peculiarities in cell organization within the spheroid. After successful dissociation of the spheroids into single cells, the data obtained for the determination of the cell area fractions were additionally verified by FACSTM (fluorescence activated cell sorting) analyses as an alternative method. By measuring the cell area percentages, it was found that the percent distributions of the cells remained relatively stable from day 1 to day 6. Both, spheroid diameters as well as absolute spheroid area decreased over time. There were no significant differences between vital spheroid diameters and diameters of the cryosections. FACSTM analysis of dissociated spheroids showed a significant decrease in the number of HDMEC with a concomitant increase in the number of NHDF over time. Furthermore, characteristic cell distributions in the spheroid were evident for certain cell types. Thus, the HDMEC in both, group I and II, were distributed over the spheroid with a somewhat more compact position at the edges. With increasing spheroid age, the HDMEC showed a slight increase in cell-free areas. The NHDF and HOB showed a similar distribution in groups I and II. On day 1, the cells were densely packed at the edge with significantly more cell-free areas toward the center of the spheroid. In group III, the HOB showed a homogeneous distribution throughout the time. The HDMEC and NHDF showed a similar distribution pattern as in groups I and II. In conclusion, live fluorescence staining has some advantages. The staining is stable when viewed under the fluorescence microscope and does not affect the viability of the cells. In addition, discrimination of different cell types is easily possible. The preparation of cryosections is also not very time consuming and relatively easy to perform. However, the method is invasive and has limitations. The sometimes high standard deviations in the determination of cell area fractions could be explained by the slightly different thickness of the cryosections. Furthermore, some spheroids showed a cell-free center. This could be explained by loss of cells during the cutting process. Therefore, testing another cutting method e.g., kerosene sections would be useful for comparison. FACSTM analysis of dissociated spheroids represents an alternative, but also synergistic, method to analyze cell area fractions. However, dissociation conditions must be chosen optimally, as overly stringent conditions can negatively affect cell viability. In summary, spheroid research represents a promising field of research in, for example, tissue engineering and angiogenesis research. The aim of the present work was to develop a reproducible method to visualize the cellular processes in the spheroid and thus contribute to further research on spheroids.