Der Einfluss der Proteinkinase CK2 auf die Glucagon-Expression der Alpha Zellen des Pankreas

Abstract

Die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase ist entscheidend für einen normalen Stoffwechsel und hängt vor allem von der regulierten Expression und Sekretion von Insulin durch die Beta-Zellen sowie von Glucagon (GCG) ab, das von den Alpha-Zellen des Pankreas produziert wird. Zahlreiche Transkriptionsfaktoren sind für die Aufrechterhaltung der Zellidentität, sowie für die Expression der antagonistisch wirkenden Hormone zuständig. Bisherige Erkenntnisse weisen darauf hin, dass die Proteinkinase CK2, welche aus zwei katalytischen α/α‘- und zwei regulatorischen β-Untereinheiten aufgebaut ist, an diesem Prozess durch aktive Phosphorylierung der Substrate und durch sekundäre Effekte, wie z.B. die Modulation von Signaltransduktionswegen, die Beeinflussung von Protein-Protein-Interaktionen oder die Stabilisierung bestimmter Proteine, in die Regulation der Insulin-Expression eingebunden ist. Allerdings ist bis heute nur wenig über die Auswirkungen einer CK2 Inhibition auf die GCG-Expression bekannt. Die vorliegende Arbeit liefert erstmals Erkenntnisse über den zugrundeliegenden Mechanismus der GCG-Expression in Alpha-Zellen nach CK2 Inhibition. In ersten Experimenten wurde untersucht, ob der neue und selektivere CK2 Inhibitor SGC-CK2-1 (SGC) die Insulin-Expression und -Sekretion ähnlich dem bereits etablierten Hemmstoff CX-4945 (CX) erhöht. Die Experimente in MIN6-Zellen zeigten, dass sowohl SGC-CK2-1 als auch CX-4945 die CK2 hemmen und die Insulin-Expression und -Sekretion steigern. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden beide CK2-Inhibitoren für die weiteren Experimente in der Alpha-Zelllinie αTC1 verwendet. Zusätzlich wurden αTC1-Knockout (KO)-Zelllinien generiert, bei denen entweder die α- oder α‘-Untereinheit mittels der CRISPR/Cas9-Methode ausgeschaltet wurde. In vitro-Analysen mittels Western Blot haben gezeigt, dass weder eine CK2-Inhibition noch ein Knockout der CK2α zu einer Phosphorylierung von Akt an Serin129 führen. Die anschließenden Viabilitätsassays ergaben, dass sowohl die CK2 Inhibition als auch der Knockout der CK2α zu einer leichten Reduktion der Proliferation und Viabilität führen. Weiterhin wurde mittels Western Blot, qRT-PCR und ELISA festgestellt, dass sowohl die CK2 Inhibition als auch der Knockout der CK2α zu einer signifikanten Reduktion der GCG-Gen- und Protein-Expression sowie der -Sekretion führen. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde mittels Reportergen-Analysen und Pull-Down-Assays entschlüsselt. Eine Inhibition und ein Knockout der CK2α führt zu einer erhöhten Expression und Bindung des Transkriptionsfaktors pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) an den GCG-Promotor. Dies wiederum führt dazu, dass die aktivierenden Transkriptionsfaktoren PAX6 und MafB von ihren Bindungsstellen verdrängt werden. Die anschließenden ex vivo Experimente mit isolierten murinen pankreatischen Inseln bestätigten die Reproduzierbarkeit der in vitro Ergebnisse und zeigten, dass diese nur in geringem Maße von der Sekretion von Insulin beeinflusst wurden. Zur weiteren Bekräftigung der Ergebnisse, wurden Pseudoinseln (PI) aus MIN6- und αTC1-Zellen oder MIN6- und αTC1 CK2α KO-Zellen generiert. Hier konnte gleichermaßen eine signifikant reduzierte GCG-Sekretion in PI mit αTC1 CK2α KO-Zellen beobachtet werden. Basierend auf den in vitro und ex vivo Experimenten wurde anschließend in einem Mausmodell gezeigt, dass Mäuse, die αTC1-Zellen unter die Nierenkapsel transplantiert bekamen, im Vergleich zur Transplantation von αTC1 CK2α KO-Zellen eine Hyperglykämie nach dem Fasten aufwiesen. Die Relevanz der erzielten Ergebnisse wurde auch durch Experimente mit isolierten humanen pankreatischen Inseln bestätigt, bei denen ebenfalls mittels ELISA eine reduzierte GCG-Sekretion nachgewiesen wurde. Die Wiederholung dieser Experimente mit der αTC1-Zelllinie welche ein Knockout der CK2α‘ aufwies, zeigte eine gegenteilige Auswirkung auf die GCG-Expression und -Sekretion. Während die Ergebnisse der Viabilitätsassays keinen Unterschied aufzeigten, konnte eine signifikant erhöhte Pro-GCG-Expression nach Knockout der CK2α‘ in Western Blots nachgewiesen werden. Die durchgeführten qRT-PCRs und ELISAs bestätigten, dass der Einfluss auch auf Promotorebene stattfand. Eine gesteigerte nucleäre Expression des Transkriptionsfaktors MafB führte zu einer erhöhten Bindung an den GCG-Promotor, während auch eine verstärkte Bindung von PAX6 an den Promotor festgestellt wurde. Zusammenfassend konnten die vorliegenden Ergebnisse erstmalig den negativen Einfluss der CK2-Inhibition auf die GCG-Expression und -Sekretion bestätigen und den zugrundeliegenden Mechanismus aufklären. Diese Erkenntnisse heben die Bedeutung der CK2-Hemmung für das Verständnis der Rolle von CK2 in der Regulation der Glukosehomöostase hervor und bieten wertvolle Ansätze, um die komplexen Mechanismen der hormonellen Steuerung des Blutzuckerspiegels weiter zu entschlüsseln.

2. Summary Maintaining glucose homeostasis is crucial for normal metabolism and depends primarily on the regulated expression and secretion of insulin by beta cells, as well as glucagon (GCG), produced by pancreatic alpha cells. Numerous transcription factors are responsible for maintaining cell identity and regulating the expression of these antagonistic hormones. Previous findings indicate that protein kinase CK2, composed of two catalytic α/α'-subunits and two regulatory β-subunits, plays a role in this process through active phosphorylation of substrates and secondary effects such as modulation of signaling pathways, influencing protein-protein interactions, and stabilizing specific proteins, thereby contributing to the regulation of insulin expression. However, the effects of CK2 inhibition on GCG expression remain poorly understood. This study provides novel insights into the underlying mechanism of GCG expression in alpha cells following CK2 inhibition. Initial experiments investigated whether the new, more selective CK2 inhibitor SGC-CK2-1 (SGC) increases insulin expression and secretion similarly to the already established inhibitor CX-4945 (CX). Experiments conducted in MIN6 cells revealed that both SGC-CK2-1 and CX-4945 inhibit CK2 and increase insulin expression and secretion. Based on these results, both CK2 inhibitors were used in further experiments with the alpha cell line αTC1. Additionally, CRISPR/Cas9 technology was employed to generate αTC1 knockout (KO) cell lines in which either the CK2α or CK2α' subunit was specifically deleted. Western blot analyses showed that neither CK2 inhibition nor CK2α knockout led to phosphorylation of Akt at serine 129. Viability assays indicated that CK2 inhibition and CK2α knockout resulted in a slight reduction in cell proliferation and viability. Furthermore, Western blot, qRT-PCR, and ELISA revealed that both CK2 inhibition and CK2α knockout significantly reduced GCG gene and protein expression, as well as GCG secretion. The underlying mechanism was elucidated using reporter gene assays and pull-down assays. CK2α inhibition or knockout led to increased expression and binding of the transcription factor pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) to the GCG promoter, displacing the activating transcription factors PAX6 and MafB from their binding sites. Ex vivo experiments with isolated murine pancreatic islets confirmed the reproducibility of these in vitro results, showing that these effects were only minimally influenced by insulin secretion. To reinforce these findings, pseudoislets (PI) were generated fromMIN6 and αTC1 cells or MIN6 and αTC1 CK2α KO cells. A significant reduction in GCG secretion was observed in PI containing αTC1 CK2α KO cells. In a mouse model, transplantation of αTC1 cells under the renal capsule led to hyperglycemia after fasting compared to transplantation of αTC1 CK2α KO cells. The relevance of these results was confirmed using isolated human pancreatic islets, which also demonstrated reduced GCG secretion via ELISA. Repeating these experiments with αTC1 cells lacking the CK2α' subunit revealed an opposite effect on GCG expression and secretion. While viability assays showed no difference, significantly increased pro-GCG expression was detected in Western blots after CK2α' knockout. qRT-PCR and ELISA confirmed that the effect occurred at the promoter level, showing increased nuclear expression of the transcription factor MafB and enhanced binding of both MafB and PAX6 to the GCG promoter. In summary, this study for the first time confirmed the negative impact of CK2 inhibition on GCG expression and secretion and elucidated the underlying mechanism. These findings highlight the importance of CK2 inhibition for understanding the role of CK2 in the regulation of glucose homeostasis and provide valuable insights for further deciphering the complex mechanisms of hormonal regulation of blood glucose levels.