Quantitative mass spectrometry-based (chemo-) proteomics for the characterization of MEP pathway inhibitors

Abstract

A critical bottleneck in early drug discovery of new agents for both bacterial and malarial pathogens is the challenge of accurately identifying protein targets, confirming target–engagement, and evaluating selectivity profiles. To that end, quantitative mass spectrometry-based proteomics (LC-MS/MS) is a powerful tool for acquiring comprehensive and unbiased information on protein expression and protein–drug interactions on a proteome-wide scale. As part of the MepAnti research program, global proteomic profiling was conducted on six human pathogens (Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Plasmodium falciparum) to assess the detectability and abundance of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway enzymes using LC-MS/MS. Subsequently, compound–protein interactions were characterized across multiple chemical classes developed within the MepAnti Consortium. Initially, we employed conventional probe-based chemoproteomics. However, this method can present challenges, as the protein targets may not be effectively enriched due to potential losses in activity and selectivity during the probe-design process. To overcome these limitations, integral solvent-induced protein precipitation (iSPP) was evaluated and subsequently employed. This biophysical proteomics approach measures changes in protein stability in response to solvent-induced precipitation in the presence of ligands, facilitating the identification of compound–protein targets. iSPP is a modification-free approach, eliminating the need for compound functionalization, and is suitable for application to hard-to-culture pathogens characterized by slow growth rates and limited protein yields. Overall, this thesis underscores the pivotal role of chemo- and biophysical proteomics in advancing early-stage drug discovery for anti-infective agents.

Ein entscheidender Engpass in der frühen Wirkstoffentwicklung für bakterielle und malariabedingte Krankheitserreger ist die präzise Identifizierung von Protein-Zielen, die Bestätigung der Zielbindung (Target Engagement) und die Bewertung der Selektivitätsprofile. Die quantitative, massenspektrometrie-basierte Proteomik (LC-MS/MS) ist ein effizientes Werkzeug, um umfassende und unverfälschte Informationen über Proteinexpression und Protein-Wirkstoff-Interaktionen auf proteomweiter Ebene zu gewinnen. Im Rahmen des MepAnti-Forschungsprogramms wurde eine globale Proteomprofilierung an sechs humanpathogenen Organismen (Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Plasmodium falciparum) durchgeführt, um die Nachweisbarkeit und Häufigkeit der Enzyme des 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-phosphat (MEP)-Stoffwechsels mittels LC-MS/MS zu bewerten. Im Anschluss daran wurden Wirkstoff-Protein-Interaktionen über mehrere chemische Klassen hinweg charakterisiert, die innerhalb des MepAnti-Konsortiums entwickelt wurden. Zunächst wurde die klassische, auf Sonden basierende Chemoproteomik eingesetzt. Allerdings können bei dieser Methode Herausforderungen auftreten, da die Zielproteine aufgrund möglicher Aktivitäts- und Selektivitätsverluste während des Sondendesigns nicht effektiv angereichert werden könnten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die integral solvent-induced protein precipitation (iSPP) evaluiert und anschließend eingesetzt. Dieser biophysikalische proteomische Ansatz misst Änderungen in der Protein-Stabilität als Reaktion auf lösungsmittelinduzierte Präzipitation in Anwesenheit von Liganden und erleichtert die Identifizierung von Wirkstoff-Protein-Zielen. iSPP ist eine modifikationsfreie Methode, die keine Wirkstofffunktionalisierung erfordert und sich für schwer zu kultivierende Krankheitserreger mit langsamen Wachstumsraten und begrenzten Proteinausbeuten eignet. Zusammenfassend unterstreicht diese Dissertation die zentrale Rolle von chemo- und biophysikalischer Proteomik bei der Förderung der Wirkstoffentwicklung in der Frühphase für Antiinfektiva.