Biophysical characterization of lipid bilayer stress sensing by the unfolded protein response transducer PERK

Abstract

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist ein Schlüsselorganell der Membranbiogenese. Die Homöostase des ER wird unter anderem durch die sogenannte Unfolded Protein Response (UPR) reguliert, die bei Säugetieren durch drei single-pass Membranproteine in der ER-Membran vermittelt wird. Da die UPR nicht nur durch ungefaltene Proteine, sondern auch durch Veränderungen der Lipidumgebung der ER-Membran selbst ausgelöst werden kann, untersucht die vor liegende Arbeit die Struktur-Funktions-Beziehungen des transmembranen Bereichs des UPR Transducers protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Dazu wurde ein minimales Membransensor-Konstrukt, basierend auf der Transmembranhelix von PERK, in verschiedenen Lipidumgebungen rekonstituiert. Das Konstrukt wurde mit jeweils einer einzelnen MTSL Sonde markiert, welche an das jeweils einzige Cystein in der PERK-Transmembranhelix gebunden wurde. Anzumerken ist, dass das native PERK ein einzelnes Cystein in der nativen Transmembranhelix enthält, welches vorher entfernt wurde, bevor andere Einzel-Cystein-Varianten erzeugt wurden. Elektronenspinresonanzspektroskopie wurde verwendet, um Einblicke in die Struktur, Dynamik und Oligomerisierung von PERK in den verschiedenen Lipidumgebungen zu gewinnen. Durch experimentelle Methoden wurden zusätzliche Einblicke in den amphipathischen-transmembranen Übergang gewonnen. Funktionell interessante Reste wurden entdeckt, wie beispielsweise ein polarer Rest, welcher in den Acylketten-Bereich der Membran hineinragt und dadurch die effiziente Inserierung der Transmembranhelix in die Lipid-Doppelschicht erschwert. Bemerkenswert ist, dass in dieser Studie eine außergewöhnliche Empfindlichkeit von PERK gegen über der Lipidumgebungen nachgewiesen werden konnte: Das Ausmaß der Oligomerisierung, gemessen an den Spin-Spin-Interaktionen, nimmt mit spezifischen Änderungen der Lipidzusammensetzung erheblich zu. Unsere Daten deuten darauf hin, dass sich PERK ähnlich wie der am stärksten konservierte UPR-Transducer Inositol-requiring Enzyme 1 (IRE1) (wie in S. cerevisiae untersucht) verhält. Systematische EPR-Daten deuten darauf hin, dass PERK Protomere miteinander assoziieren, wobei die N-terminalen Bereiche der Transmembrandomäne der Membranoberfläche "aufliegen" und von der Kontaktfläche der Proteine wegzeigen. Diese Daten liefern wichtige Eck- und Validierungspunkte für umfangreiche Molecular-Dynamic Simulationen (MD), die von den Forschungsgruppen Hummer und Covino aus Frankfurt durchgeführt werden. Basierend auf der Lipidabhängigkeit der Oligomerisierung wurde die Rolle von Lipiden auf PERK mittels spezieller Rekonstitutionsexperimente weiter untersucht. Es wurde bereits in der Literatur vorgestellt, dass PERK in stark gesättigten Membranen dimerisieren kann (Volmer, Ploeg, Ron 2013). Es blieb jedoch zu untersuchen, ob diese Lipidsensitivität auf bloße Lipidphasentrennung basiert oder ob sie die Fähigkeit von PERK zeigt, physiologisch vorkommende Lipidveränderungen zu erkennen und als Regler der Homöostase zu fungierend. Tatsächlich sind die speziellen Parameter, auf die die PERK Transmembranregion reagiert– ob nur auf Lipidpackungsdichte, Protein/Lipid-Verhältnis oder spezifische Lipidkopfgruppen– derzeit unbekannt. Um zu untersuchen, wie die Transmembranregion von PERK spezifisch auf bestimmte Lipidzusammensetzungen reagiert, wurde das minimale Konstrukt der PERK-Transmembranregion, markiert an seinem nativen Cystein mit einer MTSL-Sonde, in verschiedenen Lipidumgebungen rekonstituiert. Einzelne Komponenten der Lipidumgebung wurden auftitriert, um den Einfluss einzelner Lipide auf die Oligomerisierung zu untersuchen. Anschließend wurde die Elektronenspinresonanzspektroskopie durchgeführt, um Veränderungen in der PERK-Homodimerisierung zu identifizieren. Die komplexe Lipidumgebung CHO2 wurde ausgewählt, um eine Kombination mehrerer Merkmale zu reflektieren, die bekanntermaßen die UPR in Zellen auslösen (z.B. erhöhte Lipidsättigung, erhöhter Sterolspiegel, erhöhtes PE-zu-PC-Verhältnis). Sie löst ebenfalls eine erhöhte Oligomerisierung von PERK aus, was aus einer signifikanten spektralen Verbreiterung der EPR Spektren abgeleitet wurde. Einzelne Komponenten der CHO2-Umgebung (POPE, Cholesterin, PI) wurden auftitriert, und ein Screening wurde durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transmembranregion von PERK möglicherweise durch einen auf hydrophoben Mismatch basierenden Mechanismus reguliert wird, ähnlich wie Ire1 aus S. cerevisiae. Die Erhöhung des hydrophoben Mismatch durch die Titration von Cholesterin behinderte auch die erfolgreiche Rekonstitution von PERK, was darauf hindeutet, dass die Membraninsertion hier tatsächlich energetisch ungünstig ist.

The endoplasmic reticulum (ER) is a key organelle of membrane biogenesis. ER homeostasis is regulated by the so-called unfolded protein response (UPR), which is mediated in mammals by three single-pass membrane proteins in the ER membrane. Because the UPR can also be triggered by aberrancies in the ER membrane, this thesis investigates the structure-function relationships in the transmembrane domain of the UPR transducer PERK. A minimal membrane sensor construct based on the transmembrane helix of PERK was generated and then reconstituted in various lipid environments. The construct is labeled with spin probes, installed at the position of unique cysteines installed in the construct. Notably, PERK contains a single cysteine in its native transmembrane helix region, which was removed prior to generating other singe-cysteine variants. Electron spin resonance spectroscopy was employed to gain insight into the structure, dynamics, and oligomerization of PERK in the lipid bilayer. Through experimental means, additional insights into the amphipathic-transmembrane transition were obtained. Functionally interesting residues were discovered, such as a polar residue protruding into the acyl chain region of the membrane, thereby interfering with efficient insertion of the transmembrane helix in the lipid bilayer. Remarkably, this study demonstrates a extraordinary sensitivity of PERK to its lipid environments: The degree of oligomerization, as judged from spin-spin interactions, increases substantially with specific changes of the lipid composition. Our data suggests that PERK oligomerizes similarly to the most conserved UPR transducer inositol-requiring enzyme type 1 (IRE1) (as studied in S. cerevisiae ). Systematic EPR data suggests that PERK protomers associated with each other, having the N-terminal regions of the TMD "lying" in the membrane surface and pointing away from the dimer interface. This data provides important constraints and validation for extensive molecular dynamics (MD) simulations performed by the research groups Hummer and Covino from Frankfurt. Based on the lipid-dependency of oligomerization, the role of lipids on PERK was explored more widely using dedicated reconstitution experiments. It was previously proposed that PERK can dimerize in highly saturated membranes (Volmer, Ploeg, Ron 2013). However, whether this lipid sensitivity is based on lipid phase separation and whether it also reflects an ability of PERK to sense under more physiological conditions remained to be investigated. In fact, the parameters to which the PERK transmembrane region responds —whether only to lipid packing density, protein/lipid ratio, or specific lipid headgroups— are currently unknown. To investigate how the transmembrane region of PERK specifically reacts to certain lipid composition, the minimal construct of the PERK transmembrane region labeled at its native cysteine with a spin probe was reconstituted in various lipid environments. Individual components of the lipid mixture were titrated to study the impact of specific lipids on the oligomerization. Subsequently, electron spin resonance spectroscopy was conducted to identify changes in PERK homodimerization. The complex lipid environment CHO2, which was chosen to reflect a combination of several features which are known to trigger the UPR in cells (e.g. increased lipid saturation, increased sterol level, increased PE-to-PC ratio), also triggered an increased oligomerization of PERK, which was deduced from significant spectral broadening of the EPR spectra. Individual components of the CHO2 environment (POPE, Cholesterol, PI) were titrated, and a screening was conducted. The results indicated that the PERK transmembrane region may be regulated by a hydrophobic mismatch-based mechanism, similarly to Ire1 from S. cerevisiae. Increasing the hydrophobic mismatch through the titration of cholesterol hindered the successful reconstitution of PERK, thereby suggesting that membrane insertion indeed is energetically unfavorable.