Einfluss von Vitamin-D auf die Zusammensetzung regulatorischer Populationen tumorinfiltrierender Leukozyten und deren Effektormoleküle bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs

Abstract

Als sechst häufigste Tumorentität weltweit mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von rund 55 % gehören Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs zu den häufigsten Tumoren des Menschen und sind mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Hinzu kommt, dass unter anderem wegen der oft späten Diagnosestellung die Therapiemöglichkeiten trotz der intensiven Forschungsbemühungen der letzten Jahrzehnte nach wie vor begrenzt sind. Die häufig fortgeschrittenen Tumoren generieren zudem ein immunsuppressives Tumormikromilieu was medikamentöse Therapiemöglichkeiten weiter limitiert. All dies impliziert die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Therapieansätze. Mit seiner in der Literatur immer deutlicher belegten antitumoralen und immmunstimulierenden Wirkung bietet Vitamin-D hierbei einen vielversprechenden Ansatz. Aus mehreren Studien der vergangenen Jahre geht hervor, dass Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren oft unter einem Vitamin-D-Mangel leiden, der seinerseits wiederum mit schlechteren Prognoseaussichten assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde vor diesem Hintergrund der Einfluss des Vitamin-D-Status von Kopf-Hals-Tumorpatienten auf die antitumorale Immunabwehr durch eine differenzierte Analyse des immunologischen Tumormikromilieus untersucht. Hierfür wurden Gewebeproben von 116 Kopf-Hals-Tumorpatienten immunhistochemisch gefärbt, das Expressionsverhalten von fünf Zielproteinen analysiert und mit dem Vitamin-D Serumspiegel der Patienten korreliert. Im Einzelnen wurden dabei CD20, CTLA4, FasL, FoxP3 und IL10 untersucht. Ein Vitamin-D-Mangelzustand wurde definiert ab einem 25-OH Vitamin-D-Serumspiegel unter 10 ng/ml, was auf 63 Patienten zutraf, während 53 Patienten einen Spiegel über 25 ng/ml aufwiesen und somit zu den ausreichend mit Vitamin-D versorgten Patienten des Kollektivs gezählt wurden. Im Anschluss erfolgte die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen mit Hilfe eines immunreaktiven Scores, der für zwei der fünf Zielproteine modifiziert und für weitere zwei Zielproteine erweitert wurde, um eine optimale Auswertung zu gewährleisten. Dabei wurde für alle Marker das intratumorale und das peritumorale immunologische Tumormikromilieu getrennt ausgewertet. Die immunhistochemischen Analysen zeigten dabei am eindrücklichsten bei CD20 eine positive Korrelation zwischen einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung und einer vermehrten Infiltration CD20 exprimierender Zellen (B-Lymphozyten). Die tumorale Infiltration mit B-Lymphozyten zeigte sich bei einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung statistisch signifikant gesteigert (p=0,0289), während im peritumoralen Gewebe von einer deutlichen Tendenz hin zu einer vermehrten Infiltration gesprochen werden kann (p=0,0662). Die statistische Analyse von CTLA4, FasL, FoxP3 und IL10 ergab keine statistisch signifikante Korrelation mit dem Vitamin-D-Serumspiegel der Patienten. Allerdings zeigte das Ausmaß 1 1. Zusammenfassung der Infiltration des Tumormikromilieus mit den durch die genannten Marker untersuchten Immunzellpopulationen einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten. Insbesondere die erhöhte intratumorale Infiltration CD20 exprimierender Zellen sowie peritumorale Infiltration CTLA4 exprimierender Zellen korrelierte statistisch signifikant mit einem verlängertem Gesamtüberleben (p=0,0401 und p=0,0398). Auch die gesteigerte peritumorale Infiltration CD20 exprimierender Zellen und intratumorale Infiltration CTLA4 exprimierender Zellen zeigte eine deutliche Tendenz hin zu einem verlängerten Gesamtüberleben der Patienten (p=0,1394 und p=0,0604). FoxP3 als Surrogatmarker für regulatorische T-Zellen zeigte eine geringe, nicht-signifikante Tendenz zu einem verlängerten Gesamtüberleben bei einer hohen peri- und intratumoralen Infiltration der exprimierenden Zellen (p=0,3421 und p=0,5964). Keinen signifikanten Überlebensvorteil ergab eine gesteigerte Infiltration von FasL und IL10 exprimierender Leukozyten. Insgesamt wiesen Patienten des untersuchten Kollektivs mit einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung unabhängig von den zuvor dargestellten Markern ein statistisch signifikant verlängertes Gesamtüberleben auf verglichen mit Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel (p=0,0233). ein Zusammenfassend demonstrieren die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse, dass ausreichender Vitamin-D-Serumspiegel bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs immenser Bedeutung für die Prognose- und Therapieaussichten ist. Der Einfluss von Vitamin-D auf die Immuninfiltration des Tumormikromilieus und die Effektormoleküle einzelner Leukozyten-Subpopulationen wurde in dieser Arbeit deutlich und deutet eine stimulierende Wirkung auf die antitumorale Aktivität des Immunsystems bei Kopf-Hals-Karzinompatienten an. Perspektivisch sind weitere molekulargenetische Untersuchungen notwendig, um zusätzliche immunmodulatorische Wirkungsweisen und das antitumorale Potential von Vitamin-D zu entschlüsseln. Neben der leitliniengerechten und aktuell etablierten multimodalen Therapie von Kopf-Hals-Tumoren, könnte die kostengünstige Substitution von Vitamin-D zu einer Steigerung der Effektivität der bisherigen Therapieansätze, insbesondere der bereits klinisch etablierten Immuntherapie durch Checkpointinhibitoren, und gleichzeitig zu verbesserten Prognoseaussichten führen.

As the sixth most common tumor entity worldwide with a 5-year survival rate of around 55%, squamous cell carcinoma of the head and neck are among the most common tumors in humans and are associated with an unfavorable prognosis. In addition, despite intensive research efforts in recent decades, treatment options are still limited, partly due to the commonly late diagnosis. The often-advanced tumors also generate an immunosuppressive tumor microenvironment, which further limits drug therapy options. All together this implies the need to develop new therapeutic options. With its antitumor and immunostimulatory effects, which has been increasingly proven in the literature, vitamin-D offers a promising approach. Several studies in recent years have shown that patients with head and neck tumors often suffer from vitamin-D-deficiency, which in turn is associated with a poorer prognosis. Against this background, the present study investigated the influence of the vitamin-D-status of head and neck tumor patients on the antitumor immune defense by means of a differentiated analysis of the immunological tumor environment. For this purpose, tissue samples from 116 head and neck tumor patients were stained immunohistochemically, the expression behavior of five target proteins was analyzed and correlated with the patients´ vitamin-D-serum-levels. Specifically, CD20, CTLA4, FasL, FoxP3, and IL10 were examined. Vitamin-D-deficiency was defined as a 25-OH-vitamin-D serum-level below 10 ng/ml, which was the case for 63 patients, whereas 53 patients had a level above 25 ng/ml and thus belonged to the sufficiently vitamin-D-supplied patients of the collective. The immunohistochemical staining was then evaluated semi-quantitatively using an immunoreactive score, which was modified for two of the five target proteins and extended for further two target proteins in order to ensure optimal evaluation. The intratumoral and peritumoral immunological tumor microenvironment was evaluated separately for all markers. The immunohistochemical analyses showed a positive correlation between an adequate vitamin-D-supply and an increased infiltration of CD20 expressing cells (B lymphocytes), most impressively in the case of CD20. Tumoral infiltration with B lymphocytes was statistically significantly increased with a sufficient vitamin-D-supply (p=0.0289), while in peritumoral tissue there was a clear tendency towards increased infiltration (p=0.0662). The statistical analysis of the molecules CTLA4, FasL, FoxP3 and IL10 showed no statistically significant correlation with the vitamin-D-serum-level of the patients. However, the extent of infiltration of the tumor microenvironment with the immune cell populations examined by the aforementioned markers showed a significant influence on the overall survival of patients. In particular increased intratumoral infiltration of CD20 expressing cells and peritumoral infiltration of CTLA4 expressing cells correlated statistically significantly with prolonged overall survival (p=0.0401 and p=0.0398). Increased peritumoral infiltration CD20 expressing 3 1. Zusammenfassung cells and intratumoral infiltration CTLA4 expressing cells also showed a significant tendency towards prolonged overall patient survival (p=0.1394 and p=0.0604). FoxP3 as a surrogate marker for regulatory T-cells showed a small, non-significant trend towards prolonged overall survival with high peri- and intratumoral infiltration of the expressing cells (p=0.3421 and p=0.5964). Increased infiltration of FASL and IL10 expressing leukocytes did not result in a significant survival benefit. Overall, patients in the investigated population with an adequate vitamin-D-supply showed a statistically significant increase in overall survival compared to patients with a vitamin-D-deficiency (p=0.0233), irrespective of the markers described above. In summary, the results obtained in the present study demonstrate that a sufficient serum vitamin-D-level in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck is of immense importance for the prognosis and therapy prospects. The influence of vitamin-D on the immune infiltration of the tumor microenvironment and the effector molecules of individual leukocyte subpopulations was clearly demonstrated in this study and suggests a stimulating effect on the antitumor activity of the immune system in head and neck cancer patients. In the future, further molecular genetic studies are necessary to decipher additional immunomodulatory modes of action and the antitumor potential of vitamin-D. Besides the guideline-compliant and currently established multimodal therapy of head and neck tumors, the cost-effective substitution of vitamin-D could lead to an increase in the effectiveness of existing therapeutic options, in particular the already clinically established immunotherapy with checkpoint inhibitors, and at the same time to improved prognostic prospects.