AXER in Focus: Molecular Interplay and Structural Aspects in Cellular Models

Abstract

Unlike other cellular compartments, such as the cytosol (enabling glycolysis) or mitochondria (enabling oxidative phosphorylation), the endoplasmic reticulum (ER) operates without an autonomous metabolic pathway for the regeneration or de novo synthesis of adenosine triphosphate (ATP). Instead, the ER heavily relies on the regulated import of ATP. Recently, SLC35B1 was characterized as the ATP/ADP exchanger of the mammalian ER membrane and termed AXER. It was found that AXER is integrated into a broader signaling cascade, which includes calcium (Ca2+) as a potent second messenger. However, ongoing debates persist regarding (i) the precise role of Ca2+ as a regulator of AXER activity and (ii) the sources of ATP for the ER import. Also, unresolved inquiries revolve around AXER's interaction partners, earlier investigated in vitro by co-immunoprecipitation (co-IP) studies. To expand upon previous research, this work aimed to verify and extend interaction partners of AXER in living cells, preferably using the biomolecular luminescence complementation (BiLC). In conjunction with various experimental methodologies, including RNA sequencing (RNA-seq) and proteomic analysis, the BiLC approach successfully identified key players involved in the ER protein import and/or the ER Ca2+ homeostasis as components of the AXER interactome. Furthermore, it was observed that AXER potentially functions as a dimer or higher order oligomer. To better understand the metabolic integration of this functionally unique ER protein, the live monitoring of cellular energetic processes (glycolysis and oxidative phosphorylation) was performed after AXER depletion, revealing a decline in the overall ATP-production in cells. These findings not only bolster the earlier discoveries, but also indicate AXER's involvement in total cellular energy flow and its connection to the complex Ca2+ signaling. Clearly, both findings warrant further examination. The BiLC approach was also instrumental in demonstrating for the first time the interaction between the ER protein translocase and the luminal chaperone BiP in living, intact cells. To further investigate the dynamics of the detected protein-protein interactions (PPIs) cells were confronted with a short-term chemically induced ER stress as well as a prolonged stress condition. These studies elegantly underline the dynamic and transient nature of BiP`s interaction with the Sec61-complex, and its co-chaperone Sec63. In sum, the data offer valuable insights into the changes occurring in response to ER stress in living cells and support the idea of a regulatory function triggered by BiP binding and dissociating from partner proteins.

Im Gegensatz zu anderen zellulären Kompartimenten, wie dem Zytosol (Ort der zellulären Glykolyse) oder den Mitochondrien (Ort der oxidativen Phosphorylierung) arbeitet das endoplasmatische Retikulum (ER) ohne einen autonomen Stoffwechselweg für die Regeneration oder de-novo-Synthese von Adenosintriphosphat (ATP). Stattdessen ist das ER auf den regulierten Import von ATP angewiesen. Vor kurzem wurde SLC35B1 als der ATP/ADP-Austauscher der ER-Membran von Säugetieren identifiziert. Diese Membranprotein wurde entsprechend seiner Funktion als AXER bezeichnet. Es wurde weiterhin festgestellt, dass AXER in eine Signalkaskade eingebunden ist, die auch Kalzium (Ca2+) als potenten Botenstoff miteinschließt. Allerdings wird weiterhin ausgiebig über (i) die genaue Rolle von Ca2+ als regulatorischer Faktor zur Beeinflussung der Aktivität von AXER und (ii) die Quellen des ATP für dessen ER Import diskutiert. Offene Fragestellungen drehen sich auch um die Interaktionspartner von AXER, die zuvor in vitro durch Co-Immunopräzipitationsstudien (Co-IP) identifiziert wurden. Um in dieser Arbeit bisherige Forschungsergebnisse zu verifizieren und erweitern, sollten putative AXER-Interaktionspartner direkt in lebenden Zellen mit Hilfe eines biomolekularen Lumineszenz-Komplementations-Assays (BiLC) untersucht werden. In Verbindung mit verschiedenen experimentellen Methoden, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und Proteomanalysen, identifizierte der BiLC-Ansatz erfolgreich wichtige Akteure des AXER-Interaktoms. Gefundene Interaktionspartner von AXER agieren als Schlüsselkomponenten beim ER-Proteinimport und/oder der ER-Ca2+-Homöostase. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass AXER möglicherweise als Homo-Oligomer mit zwei oder mehr Kopien funktioniert. Zum besseren Verständnis der metabolischen Integration dieses funktionell einzigartigen ER-Proteins wurden die energetischen Prozesse Glykolyse und oxidative Phosphorylierung nach AXER-Deletion in lebenden Zellen untersucht. Es zeigte sich ein Rückgang der gesamten ATP-Produktion in den Zellen. Die Ergebnisse bestätigten nicht nur die früheren Entdeckungen, sondern deuten auch auf AXERs Beteiligung am gesamten zellulären Energiefluss und seine Verbindung zur komplexen Ca2+-Signalisierung hin. Beide Erkenntnisse erfordern eindeutig weiterführende Untersuchungen. Der BiLC-Ansatz war auch entscheidend, um erstmals die Interaktion zwischen der ER-Proteintranslokase und dem ER-luminalen Chaperon BiP in lebenden, intakten Zellen zu demonstrieren. Zur Untersuchung der Dynamik der nachgewiesenen Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) wurden die Zellen mit einem kurzzeitigen chemisch induzierten ER-Stress sowie mit lang-anhaltenden Stressbedingungen ausgesetzt. Diese Studien verdeutlichen die dynamische und vorübergehende Natur von BiPs Interaktion mit dem Sec61-Komplex und seinem Co-Chaperon Sec63. Insgesamt bieten die Daten wertvolle Einblicke in die Veränderungen, die als Reaktion auf ER-Stress in lebenden Zellen auftreten und unterstützen die Idee einer regulatorischen Funktion, die durch die Bindung und Dissoziation von BiP mit Partnerproteinen ausgelöst wird.