Untersuchung zur Optimierung der Zelloberflächenexpression in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Mithilfe von Ankerproteinen können unterschiedliche Proteine in der Zellwand von Hefezellen immobilisiert werden, was die Herstellung von Ganzzellbiokatalysatoren für den Einsatz in verschiedenen Forschungsgebieten ermöglicht. In dieser Arbeit wurden Verankerungssysteme der bakteriellen Esterase A (EstA) aus Burkholderia gladioli durch die Variation verschiedener Komponenten und die Kombination mit Ansätzen aus dem Bereich der synthetischen Biologie optimiert. Die Immobilisierungseffizienz der EstA in Saccharomyces cerevisiae war hierbei vom Ankerprotein, der Zellwandzusammensetzung des Hefestamms und einer durch verschiedene Promotor-Terminator-Paarungen regulierten Genexpression abhängig. Die Enzymaktivität konnte um einen Faktor von 4,1 gesteigert werden. Weiterhin wurde die Immobilisierung der EstA über zwei auf spezifischen Protein- Protein-Interaktionen beruhenden Systemen untersucht. Die Expression der Komponenten konnte bestätigt werden, jedoch war die Ausbildung der Interaktion nicht erfolgreich. Die Ergebnisse sollten auf die Verankerung von Kofaktor-abhängigen Dehydrogenasen übertragen werden, um neue Einblicke in die Immobilisierung von Enzymen mit verschiedenen Konformationen zu erhalten und die Generierung von Kofaktor-Regenerationssystemen in Hefen zu erleichtern. Die Erkenntnisse zur Zellwandverankerung von Enzymen in Hefen wurden erfolgreich erweitert und essenzielle Faktoren für deren Effizienz identifiziert.

By means of anchor proteins, different proteins can be immobilized on the surface of yeast cells, which enables the generation of whole-cell biocatalysts for the usage in different research areas. In this study, surface display systems of the bacterial esterase A (EstA) from Burkholderia gladioli were optimized by the variation of different components and the combination with approaches from synthetic biology. Here, the EstA immobilization efficiency in Saccharomyces cerevisiae was dependent on the cell wall anchor protein, the cell wall composition of the yeast strain as well as a differentially regulated gene expression by varying promotor-terminator pairings. Thereby, the enzyme activity could be enhanced by the factor of 4.1. Furthermore, the immobilization of EstA by two systems based on specific protein-protein-interactions was investigated. The expression of the components could be confirmed; however the formation of the interaction was not successful. The results ought to be transferred to the anchorage of cofactor-dependent dehydrogenases to gain new insights into the immobilization of enzymes with different conformations and to facilitate the generation of cofactor regeneration systems in yeast. The insights into cell wall anchorage of enzymes in yeast were successfully expanded and essential factors of its efficiency were identified.