Insights into the epigenetic role of H2A.J in radiation-induced premature senescence

Abstract

This thesis provides molecular insight into the H2A.J histone variant and its involvement in some biological processes as a reaction to ionizing radiation. The in-vitro study was conducted using WI-38 (no target (NT), knockdown (KD) and overexpressing (OE) H2A.J) cell line irradiated with 20Gy and labelled with several markers for investigating DNA damage and cell senescence. RNA-seq and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to examine the effect of H2A.J on the inflammatory response in cells. In addition, the study used assays for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) to investigate the role of H2A.J in the global chromatin conformation changes after IR. It was found that those cells, which have H2A.J involvement after radiation, show more resistance against senescence and apoptosis. Moreover, the conformational structure of the chromatin changes the global status of the transcription in the cells, especially for the senescence-associated secretory phenotype (SASP) genes in case of overexpressing H2A.J. Many changes occur in the cells during senescence, including disruptions in the nucleus and cytoplasmic organelles. Disruption in the nuclear morphology was noticed in the radiation-induced senescent cells. Mass spectrometry-based proteomics and high-resolution tools were used to look into the relation between the disrupted nuclear membrane and the characteristic markers of senescence. Our study found that the cells lost their laminB1 during senescence, which may disrupt the nuclear envelope, leading to the ejection of chromatin fragments in the cytoplasm, and activating the cGAS-STING-dependent interferon signalling. Moreover, serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) revealed the establishment of nanotubes as a result of the nucleus envelope disruption. These nanotubes may have role in the cytoplasmic chromatin fragments (CCF) ejection into the cytoplasm. After high-LET IR, the fibroblasts showed low electron density domains (LEDDs) in the nucleus caused by the centralized energy emitted next to the particle trajectories. Automated image analysis software with transmission electron microscopy (TEM) micrographs was used to detect the dynamics of DNA repair chromatin conformation. Fibroblasts were irradiated with low- and high-LET photons, and then they were labelled nanoparticles-tagged with DNA repair markers. The automated software tools were used to analyze the TEM micrographs to determine the pattern of the DNA damage post-low-LET versus high-LET IR. Most DNA double-strand breaks (DSBs) were repaired totally and no changes in chromatin condensation were visible after low-LET irradiation, but compound DNA damages were detected along the particle trajectories induced by high-LET IR causing clear-bordered LEDDs. The chromatin densities and the distribution of nanoparticles (related to LEDDs and based on size and shape) in the nucleus were determined using an AI tool. These results showed the ability of the automated precise analysis for the nanoparticles and LEDDs in micrographs to describe the DNA damage patterns in the nucleus after radiation. Additionally, an in-vivo study of H2A.J's role in senescence was conducted using H2A.J-knock-out (KO) mice. Skinfold of wildtype (WT) and KO mice were irradiated with 20Gy, and then for two weeks, the skin reactions were noticed macroscopically. Skin samples were collected, embedded, and labelled with several senescence and DNA damage markers. Transcriptome profile was examined using RNA-seq and RT-PCR, moreover, flow cytometry was used to explore the immune cell infiltration. An intensive reaction was observed on the skin of KO mice compared to WT, accompanied by enlargement of the epidermal thickness. More loss of hair follicles and their stem cells after radiation was found in KO skin which led to follicle vanishing. Also, increasing senescence gene expression was found in KO mice, which was associated with increased releasing of SASP factors. High numbers of infiltrated immune cells were found in both KO and WT; however, KO skin showed more induction of neutrophil numbers, irregular differentiation of and cornification of keratinocytes with increasing transcription of JunB after radiation in comparison to WT. In conclusion, the absence of H2A.J in irradiated keratinocytes is related to increasing senescence, SASP secretion, and immune response, combined with higher proliferation as an inflammatory reaction during radiation dermatitis.

In dieser Arbeit wurden die Histonvariante H2A.J, deren molekularbiologische Prozessierung und Beteiligung als Reaktion auf ionisierende Strahlung analysiert. Hierzu wurden in einer in-vitro-Studie WI-38-Zellen (Fibroblasten) verwendet, die unterschiedliche genetisch Modifikationen für die Histonvariante H2AJ aufwiesen (Non-Target, Knock-down, Over-expressing). Die Bestrahlung der Zellen erfolgte hochpräzise mit 20 Gy (6 MV Photonen) am Linearbeschleuniger der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie um anschließend in unterschiedlichen Zeitabständen die Auswirkungen der strahleninduzierten DNA-Schäden und Prozesse der Zellalterung mikroskopisch zu untersuchen. RNA-Seq und ELISA wurden darüber hinaus verwendet, um eine mögliche Beteiligung von H2A.J auf die Entzündungsreaktion in den Zellen zu analysieren. Ebenfalls wurde ATAC-Seq angewendet, um die Rolle von H2A.J an den strahleninduzierten Modifikationen der Chromatinstruktur zu erforschen. Hierbei wurde festgestellt, dass die Zellen, in welchen eine Beteiligung von H2A.J auf molekularer Ebene nachweisbar ist, resistenter gegenüber Alterungsprozessen und Apoptoseinduktion aufweisen. Darüber hinaus konnte beobachtet werden, dass die Modifikationen des Chromatins auch die Transkription der zellulären DNA beeinflussen, insbesondere die SASP-Gene bei einer H2A.J-Überexpression. Alterungsbedingt teilungs-unfähige seneszente Zellen weisen eine Vielzahl an Veränderungen in den zytoplasmatischen Organellen und den intra-nukleären Vorgängen auf. Bei strahleninduzierter Seneszenz wird insbesondere die Kernmorphologie beeinflusst, was mit Hilfe von massenspektrometischer Proteomanalyse und hochauflösender Mikroskopie untersucht wurde, um die Verbindung zwischengeschädigter Kernmembran und den charakteristischen Seneszenz-Markern besser zu verstehen. Hierbei wurde nachgewiesen, dass die Veränderungen in der Kernlamina durch Lamin-B1-Verlust hervorgerufen werden, was in Folge zu einem Verlust von Chromatinfragmenten (CCFs) in das Zytoplasma führen und die cGAS-STING-abhängige Interferonsignalisierung aktivieren kann. Darüber hinaus konnten mittels Serial-Blockface-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) Nanoröhren visualisiert werden, die bei dem Transport von CCFs aus dem Zellkern in das Zytoplasma beteiligt sind. Nach der Bestrahlung von Fibroblasten mit Schwerionen, die einen hohen linearen Energietransfer (high-LET) aufweisen, wurden mittels elektronenmikroskopischer Analyse in der homogenen Chromatinstruktur Bereiche mit niedriger Elektronendichte (LEDDs) sichtbar, welche durch die Ionisationsereignisse entlang der Partikelbahn verursacht wurden. Um diese zu untersuchen, wurde eine automatisierte Bildanalysesoftware (HALO) verwendet, um in den elektronen¬mikroskopischen Aufnahmen die Dynamik in der Veränderung der Chromatin¬struktur zu beobachten. Hierzu wurden DNA-Reparaturproteinen antikörperbasiert mit kolloidalen Goldpartikeln markiert, um hochaufgelöst die Induktion und Reparatur von DNA-Schäden, insbesondere Doppelstrangbrüche (DSBs), zu untersuchen und die hierdurch gewonnen Erkenntnisse mit denen nach low-LET-Bestrahlung zu vergleichen. Nach low-LET-Bestrahlung (Photonen) wurden fast alle DSBs repariert und es verblieben keine sichtbaren Chromatinveränderungen zurück. Hingegen waren nach high-LET-Bestrahlung (Schwerionen) entlang der Partikelbahn eine Vielzahl an Schäden nachweisbar, die zur Bildung der LEDDs führten. Innerhalb von diesen wurde die Chromatindichte sowie die Verteilung der mit kolloidalem Gold markierten Reparaturfaktoren mit Hilfe eines KI-basiertem Softwaretool ausgewertet. Der Einfluss von H2A.J auf die vielfältigen intrazellulären Prozesse bei Seneszenz wurde darüber hinaus in einer in-vivo-Studie an genetisch modifizierten H2A.J-knock-out-Mäusen (KO) durchgeführt und die Ergebnisse mit Wildtyp-Mäusen (WT) verglichen. Die Haut von WT- und KO-Mäusen wurden mit 20 Gy lokal bestrahlt, makroskopisch wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen die Hautreaktion beobachtet, um anschließend entnommene Haut mittels RNA-Sequenzierung und RT-PCR auf Seneszenz und DANN-Reparatur zu untersuchen, ein Transkriptomprofil zu erstellen und die Infiltration von Immunzellen mit Hilfe von Durchflouzytometre zu analysieren. Die Haut der KO-Mäuse zeigte hierbei eine intensivere Reaktion auf die Strahlung und eine Veränderung in der Epidermisdicke, einhergehend mit einem Verlust der Haarfollikelstammzellen und Haarfollikeln, im Vergleich zu den WT-Mäusen. Ebenso konnte eine erhöhte Genexpression von Seneszenz Faktoren und die Freisetzung von SASP-Faktoren festgestellt werden. Sowohl in den KO- wie auch bei den WT-Mäusen wurde eine vermehrte Infiltration der Haut durch Immunzellen nachgewiesen, jedoch zeigte die Haut der KO-Mäuse eine Vermehrung der Neutrophilen, eine unregelmäßige Differenzierung und Verhornung von Keratinozyten sowie eine Zunahme der JunB-Transkription im Vergleich zur Haut der WT-Mäuse. Zusammenfassend wurde die Erkenntnis gewonnen, dass das Fehlen von H2A.J in bestrahlten murinen Keratinozyten, die zunehmende Seneszenz, SASP-Sekretion und Immunreaktionen sowie die erhöhte Proliferation mit der Entzündungsreaktion während der Strahlendermatitis zusammenhängt.