MICOS und OPA1: Architekten mitochondrialer Membransysteme

Abstract

Mitochondrien werden aufgrund ihrer evolutionären Abstammung von α-Proteobakterien von zwei Membranen ummantelt. Die innere Mitochondrienmembran kann wiederum in die innere Grenzmembran und die in die Matrix ragenden Cristae-Membranen unterteilt werden, welche an den sogenannten crista junctions miteinander verbunden sind. Die durch diesen Aufbau entstehenden Cristae, in denen die mitochondriale Atmungskette lokalisiert ist, sind entscheidend an der Aufrechterhaltung mitochondrialer Funktionalität und Dynamik beteiligt. Schlüsselspieler der Entstehung und Aufrechterhaltung der Cristae-Morphologie sind der in den crista junctions lokalisierte Proteinkomplex mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS), welcher sich aus dem MIC10- und dem MIC60-Subkomplex zusammensetzt, sowie die GTPase optic atrophy type 1 (OPA1). OPA1 wiederum wird durch die stresssensitive Metalloprotease overlapping with m-AAA-Protease (OMA1) als Reaktion auf mitochondrialen Stress prozessiert. In den letzten Jahren konnten zwar große Fortschritte bei der Erforschung von MICOS und OPA1 und ihrer jeweiligen Funktionen erzielt werden, dennoch sind nach wie vor viele zentrale Fragen zum Verständnis der Bildung und Aufrechterhaltung von Cristae-Membranen ungeklärt. Aufgrund der großen klinischen Relevanz des Themas, beschloss ich daher im Rahmen meiner Arbeit zu untersuchen, wie das Wechselspiel zwischen MICOS und OPA1 die Cristae-Biogenese und -Dynamik beeinflusst. Hierbei suchte ich nach direkten Wechselwirkungen zwischen MICOS und OPA1, sowie nach Reaktionen auf Seiten des einen Partners, wenn man den anderen verändert. Hierfür arbeitete ich mit den beiden Zelllinien HEK293T und HeLa. Anders als in der Literatur beschrieben, konnte ich bei der Durchführung einer Immunpräzipitation keine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen OPA1 und dem MICOS-Komplex in Wildtyp-Zellen nachweisen. Bei der Untersuchung von OPA1 bzw. dessen Oligomeren gelang es mir an isolierten Mitochondrien, denen die MICOS-Untereinheit MIC10 fehlt (ΔMIC10), Hinweise zu finden, die auf eine Interaktion zwischen MIC10 und OPA1 im Wildtyp schließen lassen. Weiterhin gelang es durch elektronenmikroskopische Untersuchung und Messung des Sauerstoffverbrauchs in ΔMIC10-Zellen, in denen OPA1 durch Transfektion mit gegen die GTPase gerichtete siRNA ausgeschaltet wurde, zu bestätigen bzw. neu herauszufinden, dass OPA1 entscheidend für die Aufrechterhaltung der crista junctions und damit die optimale Leistungsfähigkeit der mitochondrialen Atmungskette ist. Weiterhin konnte ich Hinweise finden, die darauf schließen lassen, dass Zellen als Reaktion auf eine gefährdete Cristae-Architektur verminderte Mengen an OMA1 exprimieren. Um die Auswirkungen mitochondrialen Stresses auf die beiden Schlüsselspieler der Aufrechterhaltung der Cristae -Morphologie zu untersuchen, arbeitete ich mit dem Entkoppler der mitochondrialen Atmungskette Trifluoromethoxycarbonylcyanidephenylhydrazone (FCCP). Hierunter konnte ich bestätigen, dass sowohl der MICOS-Komplex und OPA1 als auch dessen Oligomere eine deutliche, aber dennoch reversible Destabilisierung bzw. Prozessierung unter mitochondrialem Stress erfahren. Als neue Erkenntnis habe ich herausgefunden, dass das MIC10-Protein eine schützende Funktion auf die übrigen zum MIC10-Subkomplex gehörenden Proteine innehat. MIC10 wird unter mitochondrialem Stress zuerst abgebaut, während die restlichen zum MIC10-Subkomplex gehörenden Proteine unter diesen Bedingungen nach wie vor stabil sind. Ich vermute, dass entweder das OPA1-Protein direkt oder aber die für die Prozessierung von OPA1 verantwortliche, aktivierte Metalloprotease OMA1 für diese Destabilisierung verantwortlich ist. Zwar konnte im Rahmen meiner Arbeit unter Wildtyp-Bedingungen keine nennenswerte direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen MICOS und OPA1 festgestellt werden. Ein anderes Bild ergab sich aber in Zellen mit einem mutations- bzw. stressbedingt destabilisierten MICOS. OPA1 scheint unter diesen Bedingungen mit dem MIC10-Subkomplex zu interagieren und könnte – gemeinsam mit der Metalloprotease OMA1 - die Stabilität der MICOS-Subkomplexe regulieren.

Due to their evolutionary descent from α-proteobacteria, mitochondria are encased in two membranes. The inner mitochondrial membrane can in turn be subdivided into the inner boundary membrane and the cristae membranes that protrude into the matrix, which are connected to each other at the so-called crista junctions. The cristae formed by this structure, in which the mitochondrial respiratory chain is localized, play a decisive role in maintaining mitochondrial functionality and dynamics. Key players in the development and maintenance of cristae morphology are the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) protein complex, which is localized in the crista junctions and consists of the MIC10 and MIC60 subcomplexes, and the GTPase optic atrophy type 1 (OPA1). OPA1, in turn, is processed by the stress-sensitive metalloprotease overlapping with m-AAA protease (OMA1) in response to mitochondrial stress. In recent years, great progress has been made in the study of MICOS and OPA1 and their respective functions; however, many central questions regarding the understanding of the formation and maintenance of cristae membranes remain unanswered. Due to the high clinical relevance of this topic, I decided to investigate how the interplay between MICOS and OPA1 influences cristae biogenesis and dynamics. I was looking for direct interactions between MICOS and OPA1, as well as for reactions on the part of one partner when the other is altered. For this purpose, I worked with the two cell lines HEK293T and HeLa. Contrary to what is described in the literature, I was unable to demonstrate a direct protein-protein interaction between OPA1 and the MICOS complex in wild-type cells when carrying out immunoprecipitation. Nevertheless, by examining OPA1 or its oligomers on isolated mitochondria lacking the MICOS subunit MIC10 (ΔMIC10), I was able to find evidence suggesting an interaction between MIC10 and OPA1 in the wild type. Furthermore, electron microscopic examination and measurement of oxygen consumption in ΔMIC10 cells, in which OPA1 was knocked down by transfection with siRNA directed against the GTPase, confirmed or newly revealed that OPA1 is crucial for the maintenance of crista junctions and thus the optimal performance of the mitochondrial respiratory chain. Furthermore, I found evidence suggesting that cells express reduced levels of OMA1 in response to compromised cristae architecture. To investigate the effects of mitochondrial stress on the two key players in the maintenance of cristae morphology, I worked with the uncoupler of the mitochondrial respiratory chain trifluoromethoxycarbonylcyanidephenylhydrazone (FCCP). This allowed me to confirm that both the MICOS complex and OPA1, as well as its oligomers, undergo a clear but reversible destabilization or processing under mitochondrial stress. As a new finding, I succeeded in discovering that the MIC10 protein has a protective function on the other proteins belonging to the MIC10 subcomplex. MIC10 is degraded first under mitochondrial stress, while the other proteins belonging to the MIC10 subcomplex are still stable under these conditions. I suspect that either the OPA1 protein directly or the activated metalloprotease OMA1 responsible for the processing of OPA1 is responsible for this destabilization. My work did not reveal any significant direct protein-protein interaction between MICOS and OPA1 under wild-type conditions. However, a different picture emerged in cells with a mutation- or stress-induced destabilized MICOS. OPA1 appears to interact with the MIC10 subcomplex under these conditions and could - together with the metalloprotease OMA1 - regulate the stability of the MICOS subcomplexes.