Advanced production of the antimicrobial peptide pediocin PA-1 in metabolically engineered Corynebacterium glutamicum

Abstract

Antimicrobial peptides possess significant application potential in medicine and the food industry. Their provision is typically achieved through the cultivation of native producers, which is associated with high costs. A promising model peptide is pediocin PA-1, which belongs to the bacteriocins group and is highly effective against the pathogen L. monocytogenes. The recently established heterologous production in the soil bacterium C. glutamicum has enabled extensive optimization strategies. Microarray analyses confirmed the high robustness of the alternative host organism, allowing for the successive adjustment of process parameters such as oxygen concentration, medium composition, and pH. It was found that oxygen limitation combined with an acidic environment was particularly advantageous for pediocin PA-1 production. The initially assumed positive impact of the overexpression of various stress response-associated genes was not observed. Subsequently, the cultivation of producers was carried out in bioreactors with simultaneous control of the optimized parameters. The already established inducible strain C. glutamicum pXMJ19 Ptac pedACDCgl and C. glutamicum pClik 5α Ptuf pedACDCgl with constitutive production were used. This led to an increase in production by 560% (66 μg mL-1) and 320% (42 μg mL-1), respectively, compared to previously described fermentation processes. For further optimization of peptide production, the plasmid copy number was deliberately varied to enhance gene expression. Based on the expression of the reporter protein mCherry, the influence of various mutations in the ORI region of the base vector pClik 5α was investigated and compared with the vectors pXMJ19 and pCes. Subsequent transcriptome analyses demonstrated the regulation of genes associated with stress, metabolism, and transport. Using the newly established pediocin PA-1 producer, whose production was based on the plasmid with the highest observed copy number, a product titer of 52 μg mL-1 was achieved. This corresponds to an activity of 105,722 BU mL-1, matching the highest production achieved so far without active process control.

Antimikrobielle Peptide zeichnen sich durch ein hohes Anwendungspotential in der Medizin und Lebensmittelindustrie aus. Hierfür erfolgt die Bereitstellung durch die Kultivierung nativer Produzenten, welche mit hohen Kosten verbunden ist. Ein vielversprechendes Modelpeptid ist Pediocin PA-1, welches zur Gruppe der Bacteriocine gehört und sich durch eine hohe Wirksamkeit gegenüber des Pathogens L. monocytogenes auszeichnet. Die kürzlich etablierte heterologe Produktion im Bodenbakterium C. glutamicum ermöglichte umfangreiche Optimierungsstrategien. Microarray-Analysen bescheinigten dem alternativen Wirtsorganismus eine hohe Robustheit, sodass die verwendeten Prozessparameter wie Sauerstoffkonzentration und die Zusammensetzung und pH des Mediums sukzessive angepasst wurden. Dabei erwies sich eine Sauerstofflimitierung zusammen mit einem sauren Milieu als besonders vorteilhaft für die Pediocin PA-1 Produktion. Der zunächst angenommene positive Einfluss der Überexpression verschiedener Stressantwort assoziierter Gene blieb aus. Anschließend erfolgte die Kultivierung der Produzenten in Bioreaktoren mit simultaner Kontrolle der optimierten Parameter. Verwendet wurde der bereits etablierte, induzierbare Stamm C. glutamicum pXMJ19 Ptac pedACDCgl sowie C. glutamicum pClik 5α Ptuf pedACDCgl mit konstitutiver Produktion. Dabei konnte die jeweilige Produktion um jeweils 560% (66 μg mL-1) und 320% (42 μg mL-1) gegenüber zuvor beschriebener Fermentationsprozesse gesteigert werden. Zur weiteren Optimierung der Peptidproduktion wurde die Plasmidkopienzahl zur Erhöhung der Genexpression gezielt variiert. Basierend auf die Expression des Reporterproteins mCherry wurde der Einfluss verschiedener Mutationen im ORI-Bereich des Basisvektors pClik 5α untersucht und mit den Vektoren pXMJ19 und pCes verglichen. In angeschlossene Transkriptom-Analysen wurde die Regulierung Stress, Metabolismus und Transport assoziierter Gene nachgewiesen. Mittels des neu etablierten Pediocin PA-1 Produzent, dessen Produktion auf dem Plasmid mit der höchst nachgewiesen Kopienzahl basierte, konnte ein Produkttiter von 52 μg mL-1 erreicht werden. Dies entspricht einer Aktivität von 105.722 BU mL-1, was der höchsten bisher erreichten Produktion ohne aktive Prozesskontrolle gleichkommt.