Application of stool-based multiplex real-time PCR for persistent digestive disorders in Mali and Côte d'Ivoire

Abstract

Background Persistent digestive disorders are common and challenging clinical entities in the tropics. While acute gastrointestinal diseases are frequently self-limiting, the clinical management of persistent diarrhoea (≥14 days) and persistent abdominal pain (≥14 days) is more complex. Currently employed diagnostic tools lack sensitivity, and hence, the infectious aetiology and appropriate treatment of persistent digestive disorders remain to be elucidated in endemic settings. The current MD thesis is part of an international research consortium (NIDIAG) and aims at contributing to an improved understanding of the aetiology of persistent digestive symptomatologies in resource-constrained settings. To this end, multiplex polymerase chain reaction (PCR) assays for intestinal pathogens were employed on stool samples stemming from Mali and Côte d’Ivoire. Methods Stool samples from patients with persistent diarrhoea (defined as ≥3 liquid bowel movement per day lasting ≥14 days) and/or persistent abdominal pain (defined as localised or diffuse abdominal pain for ≥14 days) and matched asymptomatic controls were collected in Niono, Mali, and Dabou, Côte d’Ivoire. All specimens were fixed in ethanol and transferred to Homburg, Germany, where nucleic acid extraction was performed. Subsequently, the samples were subjected to multiplex real-time PCR for the detection of six pathogenic bacteria (Campylobacter spp., three Escherichia coli pathovars, Salmonella spp. and Yersinia enterocolitica) and four intestinal protozoa (Cryptosporidium spp., Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica and Giardia intestinalis). Cycle threshold (Ct) values were determined as a proxy for infection intensity. Results The study cohort in Mali comprised 553 patients and 547 asymptomatic controls. 79.7% of all cases and 75% of all asymptomatic controls were infected with at least one pathogen (p-value≥0.05). 259 symptomatic cases and 260 controls were enrolled in Côte d’Ivoire; 62.5% of the cases and 44.2% of the matched controls were infected (p-value ≤ 0.0001). Multiple infections with ≥3 pathogens were common in the entire study cohort. The most frequently detected pathogens were enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) (Mali: 39.9%; Côte d’Ivoire: 21.6%), Campylobacter spp. (Mali: 35.3%; Côte d’Ivoire: 17.7%), and G. intestinalis (Mali: 20.5%; Côte d’Ivoire: 11.6%). Campylobacter, G. intestinalis, enteroinvasive E. coli (EIEC) and enterotoxigenic E. coli (ETEC) were significantly more common in cases as compared to controls. However, for most pathogens, there was no significant difference in infection intensity. Conclusions Stool-based multiplex PCR identified a high prevalence of multiple pathogens in stool samples from two sub-Saharan African settings. However, PCR results did not allow for an accurate discrimination between patients and asymptomatic controls, and thus did not provide sufficient guidance for clinical management. Nucleic acids of infectious pathogens might be shed for prolonged periods after symptom clearance, which limits the utility of highly sensitive, molecular tests in endemic areas of the tropics. Further research is warranted to elucidate the causal role of bacteria and protozoa in the development of persistent digestive disorders.

Hintergrund Persistierende Verdauungsstörungen stellen ein häufiges und zugleich herausforderndes Erkrankungsbild in den Tropen dar. Im Gegensatz zu einer akuten Durchfallepisode lässt sich die Ursache persistierender Diarrhöen (≥14 Tage) und persistierender Abdominalschmerzen (≥14 Tage) aufgrund mangelnder sensitiver Diagnostik nur unzureichend aufklären und folglich selten gezielt therapieren. Die vorliegende Dissertation ist Teil eines internationalen Forschungsprojektes (NIDIAG), welche die Ätiologie untersucht, die persistierenden Verdauungsstörungen in benachteiligten Endemiegebieten zugrunde liegt. Hierzu wurden Stuhlproben aus Mali und Côte d‘Ivoire mittels multiplexer Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) auf gastrointestinale Erreger untersucht. Methoden Zur Analyse wurden Stuhlproben von Patienten mit persistierenden Diarrhöen (≥3 breiige bis wässrige Stuhlgänge pro Tag seit mindestens 14 Tage) und/oder persistierenden Abdominalschmerzen (lokal begrenzte oder diffuse Abdominalschmerzen seit mindestens ≥ 14 Tage) und passenden asymptomatischen Kontrollpatienten aus Niono/Mali, und Dabou/Côte d’Ivoire, in Ethanol fixiert und nach Homburg/Deutschland, transportiert. Hier erfolgte die automatisierte DNA-Extrahierung mit anschließender multiplexer Echtzeit-PCR, welche die Stuhlproben auf sechs Bakterien (Campylobacter spp., drei Escherichia coli Pathovare, Salmonella spp. und Yersinia enterocolitica) und vier Parasiten (Cryptosporidium spp., Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica und Giardia intestinalis) untersuchte. Ergebnisse Die Studienkohorte in Mali umfasste 553 Patienten und 547 Kontrollen. 79.7% aller Fälle und 75% aller Kontrollen zeigten Infektionen mit mindestens einem Erreger auf (p-Wert ≥0,05). In Côte d‘Ivoire waren 62,5% der 259 Fälle und 44,2% der 260 Kontrollen infiziert (p-Wert ≤ 0,0001). In der Gesamtkohorte waren Infektionen mit ≥3 Pathogenen häufig anzutreffen. Die meist detektierten Pathogene waren enteroaggregative E. coli (EAEC) (Mali: 39,9%; Côte d’Ivoire: 21,6%), Campylobacter spp. (Mali: 35,3%; Côte d’Ivoire: 17,7%) und G. intestinalis (Mali: 20,5%; Côte d’Ivoire: 11,6%). Mit Ausnahme von Campylobacter, G. intestinalis, EIEC ipaH und ETEC LT, blieb ein signifikanter Unterschied sowohl in den Prävalenzen als auch in der Infektionsintensität meist aus.

Schlussfolgerungen Die stuhlbasierte multiplexe PCR erwies sich als eine schnelle Methodik zur Identifizierung von multiplen Pathogenen in hochprävalenten Gebieten Westafrikas, konnte jedoch zwischen symptomatischen und asymptomatischen Patienten nicht differenzieren. Gründe dafür könnte u.a. der Verbleib von Rest-DNA nach ausgeheilter Infektion sein, welcher die Sensitivität der PCR negativ beeinflusste. Folglich führten PCR-Resultate nur zu einem begrenzten Zusatzgewinn für das klinische Vorgehen. Fortführende Untersuchungen werden dahingehend stark empfohlen, um die komplexe Genese, welche zu persistierenden Verdauungsstörungen führt, aufzuklären.