Monolayer vs. Sphäroid : Einfluss auf die lokale Progression und Metastasierung im orthotopen Prostatakarzinom Modell

Abstract

Das Prostatakarzinom zählt weltweit zu den häufigsten malignen Erkrankungen des Mannes. Es manifestiert sich vorwiegend im hohen Lebensalter und ist nach wie vor mit einer hohen Morbidität und Mortalität vergesellschaftet. Die Relevanz dieser Tumorerkrankung wird in Anbetracht des demographischen Wandels stetig zunehmen. Die diagnostischen und therapeutischen Optionen sind aufgrund des mangelnden Verständnisses der ausgesprochen komplexen und heterogenen Biologie des Prostatakarzinoms limitiert. Bislang sind präklinische Modelle zur Erfassung und Abbildung dieser Tumorbiologie in In-vitro und In-vivo- Systemen rar. In den letzten Jahren sind in der onkologischen Forschung verstärkt dreidimensionale Zellkulturmodelle in den wissenschaftlichen Fokus gerückt. Dreidimensionale Sphäroid-Kulturen sind multizelluläre Tumore, welche einen natürlichen Sauerstoff- und Nährstoffgradienten ausbilden und somit das natürliche Tumormilieu repräsentativer rekapitulieren als konventionelle zweidimensionale Zellkulturmodelle. Bisher existieren für das Prostatakarzinom keine detaillierten Untersuchungen über die Generierung und Charakterisierung von Sphäroiden aus Monolayer-Zellen in vitro. In-vivo-Xenograft-Modelle in der Prostatakarzinomforschung verwenden überwiegend zweidimensionale Monolayer-Zellen als Ausgangsmaterial. Orthotop sind bislang keine Prostatakarzinomzellen in dreidimensionaler Form implantiert worden. Es existieren also bisher keine Informationen zu potenziellen Effekten der dreidimensionalen Struktur auf das Tumorverhalten nach Implantation im In-vivo-Xenograft-Modell. Folglich war das Ziel dieser Arbeit, zunächst die Etablierung einer zuverlässigen Methode zur Herstellung von dreidimensionalen Prostatakarzinom-Sphäroiden aus LNCaP Monolayer-Zellen und anschließend die Analyse der Proliferation und Viabilität. Daraufhin wurde eine Methodik zur intraprostatischen Implantation von LNCaP-Sphäroiden etabliert, um schließlich das Tumorwachstum und die Metastasierung von LNCaP-Sphäroiden und LNCaP Monolayer-Zellen im orthotopen Xenograftmodell zu vergleichen. Hierfür wurde das lokale Tumorwachstum mittels hochauflösender dreidimensionaler Kleintiersonographie und Serum PSA-Bestimmungen über 20 Wochen beobachtet. Die Detektion von Metastasen erfolgte mit Kleintier-Computertomographie und einer abschließenden Autopsie. Die dabei gewonnenen Organpräparate wurden auf die Expression von prostatakarzinomtypischen Markern untersucht. LNCaP-Zellen bildeten in Ultra-Low-Attachment Rundboden-Platten binnen drei Tagen spontan LNCaP-Sphäroide, welche im Verlauf kondensierten. Die Sphäroide proliferierten kontinuierlich und erreichten eine drei- bis zehnfache Zellzahl nach zehn Tagen. Die höchste Zellviabiliät (ca. 70%) war nach sechs Tagen zu verzeichnen. In der Peripherie der Sphäroide waren Zellen stark proliferativ, während zentral Nekrosen zu erkennen waren. Sie zeigten positiv Signale für Ki67, Androgen-Rezeptor, CK8, alpha-Methyl-CoA-Racemase und E-Cadherin, während CK5 sowie Vimentin negativ waren. LNCaP-Sphäroide konnten erfolgreich in die Prostata von immundefizienten SCID-Mäusen injiziert werden. Die Entwicklung eines Prostatakarzinoms wurde in 50 % (4/8) der Mäuse nach Sphäroid- Inokulation und 50 % (4/8) der Mäuse nach Implantation einer Einzelzellsuspension beobachtet. Sphäroid-Karzinome bildeten zu 75 % Lungen- und Lymphknotenmetastasen, wohingegen nur jedes zweite Versuchstier nach Injektion einer Einzelzellsuspension aus einer Monolayerkultur Metastasen aufwies. Die Primärtumore von LNCaP-Sphäroiden entwickelten sich deutlich früher und zeigten eine kürzere Tumorverdopplungszeit mit Ausbildung von erheblich größeren Tumorvolumina. Dies spiegelte sich in einer stärkeren immunhistochemischen Expression des Proliferationsmarkes Ki-67 und des Androgenrezeptors wider. Weiterhin korrelierten die Serum PSA-Werte stark mit dem sonographischem Tumorvolumen. Zusammenfassend ist es gelungen, ein dreidimensionales In-vivo-Sphäroid-Modell des Prostatakarzinoms zu etablieren, welches als Grundstein für die Implementierung von dreidimensionalen In-vivo-Modellen fungiert und die Entwicklung von neuen therapeutischen und diagnostischen Ansätzen anstoßen kann.

Monolayer versus spheroid: the impact on local progression and metastasis in an orthotopic prostate cancer mouse model Prostate cancer is one of the most frequent malignant diseases in men worldwide. It predominantly occurs in the elderly and remains linked to a high morbidity and mortality rate. The relevance of prostate cancer will steadily increase in view of the demographic transformation. Diagnostic and therapeutic options are limited due to the lack of understanding of the distinctly complex and heterogeneous biology of prostate cancer. To date, preclinical models to capture and recapitulate this complex tumor biology are scarce. In recent years, three-dimensional cell culture models have gained increased scientific interest in oncologic research. Three-dimensional spheroid cultures are multicellular tumors that form a natural oxygen and nutrient gradient and thus recapitulate the natural tumor environment more representatively than conventional two-dimensional cell culture models. As for prostate cancer, detailed studies on the generation and characterization of spheroids from monolayer cells in vitro do not exist. In vivo xenograft models in prostate cancer research overwhelmingly utilize two-dimensional monolayer cells for implantation. Orthotopically, threedimensional prostate cancer cells have not been implanted to date. Hence, information on potential effects of the three-dimensional structure on tumor characteristics in in-vivo models do not exist up to this point. Consequently, the objective of this thesis was to first establish a reliable method for generating three-dimensional prostate cancer spheroids from LNCaP monolayer cells and to analyze their proliferation and viability. Subsequently, a methodology for intraprostatic implantation of LNCaP spheroids was established to ultimately compare tumor progression and metastasis of LNCaP spheroids and LNCaP monolayer cells in our orthotopic xenograft model. Herein, local tumor growth was monitored by high-resolution three-dimensional small animal ultrasonography and serum PSA measurements over 20 weeks. Metastases were detected by small animal computed tomography and by terminal autopsy. Retrieved organs were histologically analyzed for the expression of prostate carcinoma typical markers. LNCaP cells spontaneously formed LNCaP spheroids in ultra-low attachment round-bottom plates within three days and progressively densified. The spheroids proliferated with a three- to tenfold increase in cell number by ten days. Cell viability peaked after six days (about 70%). The spheroids revealed proliferating cells in the periphery and central necrosis. They were positive for Ki67, CK8, androgen receptor, alpha-methyl-CoA racemase, and E-cadherin and negative for CK5 and vimentin. LNCaP spheroids were successfully injected into the prostates of immunodeficient SCID mice. Prostatic tumor development was observed in 50% (4/8) of mice after spheroid implantation and 50% (4/8) of mice after implantation of a single cell suspension. Spheroid tumors formed lung and lymph node metastases in 75%, whereas only every second experimental animal showed metastases after monolayer cell injection. The primary tumors of LNCaP spheroids noticeably evolved at an earlier stage and exhibited a reduced tumor doubling time whilst developing substantially greater tumor volumes. Indeed, this was reflected in a stronger immunohistochemical expression of the proliferation marker Ki-67 and the androgen receptor in spheroid tumors. Furthermore, serum PSA levels correlated strongly with sonographic tumor volume. In conclusion, we successfully established a three-dimensional in vivo spheroid model of prostate cancer, which may serve as a landmark for the implementation of three-dimensional orthotopic in vivo models and may stimulate the discovery of new therapeutic and diagnostic approaches.