Untersuchungen zum Clustering von KDEL-Rezeptoren und deren Transportdynamiken an der Oberfläche von Säugerzellen

Abstract

Die Hauptfunktion von KDEL-Rezeptoren (KDELRs) liegt in der Retention löslicher ER-residenter Proteine. Ein Teil der KDELRs ist jedoch an der Plasmamembran von Hefe- und Säugerzellen lokalisiert, wo die Rezeptoren extrazelluläre Liganden binden und internalisieren können. Hierbei vollziehen sie einen dynamischen Clusteringprozess, welcher in dieser Arbeit mit Hilfe fluoreszierender Rezeptor-Liganden in humanen und murinen Zelllinien mittels „Live Cell Imaging“ untersucht wurde. Dadurch konnten zelltypspezifische Unterschiede detektiert und ein Modell etabliert werden, welches den Zusammenhang zwischen Clusterentwicklung und KDELR-Internalisierung bzw. -Recycling beschreibt. Zusätzlich zeigten weder Untersuchungen von KDELR-Knockout-Zelllinien noch RT-qPCR-basierte Expressionsanalysen eine Korrelation zwischen Clusterentstehung und Expression einzelner KDELR-Subtypen. Des Weiteren konnten Immunfluoreszenzstudien mit stabil transfizierten Säugerzellen erste Einblicke in die KDELR-Oberflächendynamik in einem antikörperbasierten System vermitteln. Darüber hinaus wurden potenzielle Transportinteraktionen von allen KDELR-Subtypen in Colokalisationsstudien mit eGFP-markierten Rab-Proteinen beobachtet und so erste Hinweise auf das komplexe Interaktom dieser faszinierenden Rezeptoren gewonnen.

The retention of a subset of soluble ER-resident proteins is a well-known function of KDEL receptors (KDELRs). A fraction of KDELRs is also localized on the surface of yeast and mammalian cells, where the receptors can bind and internalize extracellular ligands. Thereby, KDELRs undergo a dynamic clustering process, which is investigated in this work by using a fluorescent KDELR model ligand on human and murine cell lines via live cell imaging. While particular differences could be observed in several cell types, macrophages of both species did not show any cluster formation. A mathematical model was established to describe the relationship between KDELR internalization and recycling that allows cluster formation. Additionally, the role of KDELR subtypes was further adressed in respective knockout cell lines as well as RT-qPCR based expression analyses without finding a clear relationship between the clustering process and single KDELR subtypes. Furthermore, stably transfected cell lines faciliated a first insight into the dynamics of KDELRs on cell surfaces in an immunolabeling approach. To depuzzle the complex transport related KDELR interactome, intensive colocalization studies with eGFP labeled Rab proteins and KDELR variants were performed, giving first hints towards diverse transport regulations of these fascinating receptors.