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doi:10.22028/D291-43652
Titel: | Innovative MALDI-TOF mass spectrometry techniques to improve the diagnosis of parasites and bacteria in clinical samples |
VerfasserIn: | Sy, Issa |
Sprache: | Englisch |
Erscheinungsjahr: | 2024 |
Erscheinungsort: | Homburg/Saar |
DDC-Sachgruppe: | 570 Biowissenschaften, Biologie 610 Medizin, Gesundheit |
Dokumenttyp: | Dissertation |
Abstract: | Introduction: Parasitic helminth infections and bacterial bloodstream infections (BSI) are major health problems affecting millions of people worldwide. Helminthic parasites are mainly found in tropical and subtropical areas, especially in low and middle-income countries (LMICs), where poor sanitation and hygiene conditions can increase disease transmission and the risk of infection. Most helminth infections (e.g. taeniasis, schistosomiasis, ascariasis, trichuriasis, and hookworm infection) are part of the so-called neglected tropical diseases (NTDs) and mainly lead to chronic morbidity such as persistent diarrhea, stunting or anemia. In contrast, BSI are acute, life-threatening events and are characterized by the presence of bacterial or fungal pathogens in the blood. The routine microbiological diagnosis of BSI and helminths relies mainly on blood culture and microscopic examination of parasite eggs, respectively. Both techniques have limitations, e.g. with regard to diagnostic accuracy, and there is a need to improve laboratory detection methods. Many efforts have been made through the development of new tools such as polymerase chain reaction (PCR), or matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS). MALDI-TOF MS has become the gold standard method for bacterial diagnosis in many laboratories, particularly in high-income settings. This thesis aims to investigate and evaluate the capacity of innovative MALDI-TOF MS approaches to improve the diagnosis of helminthic parasites and BSI in different scenarios.
Methods: MALDI-TOF MS was employed for identification of different helminths by creating an in-house database containing protein spectra profiles (reference spectra, also known as main spectra profiles; MSP) that were generated from protein extracts obtained from a portion of the worm or the entire worm, depending on the size. Adults trematodes stemming from animals (Fasciola gigantica, and F. hepatica isolated from slaughtered cattle in Nigeria and Switzerland, respectively; Schistosoma mansoni and S. japonicum isolated from experimental mice in Japan), and cestodes (Taenia saginata proglottids isolated from stool samples of infected patients in Switzerland) were analyzed by MALDI-TOF MS for species identification. Subsequently, the effect of different sample storage media (e.g., ethanol, sodium chloride, formalin, or RNAlater) on spectra acquisition and the diagnostic accuracy was also investigated. In a second part of the thesis, a validation of the commercially available FAST™ System for improved and more rapid MALDI TOF-based BSI identification was performed. The system allows the purification of microorganisms in patient blood samples without an otherwise necessary subculture step by generating a so-called liquid colony (LC). LC-based MALDI-TOF MS was compared to the reference method based on culture-grown colonies by prospectively analyzing 261 positive blood culture (PBC) samples collected on different wards at Saarland University Medical Center in Homburg. Additionally, antimicrobial susceptibility testing (AST) patterns following LC processing were compared to the reference standard (i.e., broth microdilution by MicroScan WalkAway performed on grown colonies, and directly inoculated disk diffusion).
Results: The helminth studies revealed that adult trematodes (Fasciola spp., and Schistosoma spp.) and cestodes (T. saginata) can reliably be identified by MALDI-TOF MS with identification rates ranging between 98.7%-100% for Fasciola spp., 81% (species level) and 100% (genus level) for Schistosoma spp., and 97.2%-99.7% for T. saginata. In addition, it was shown that prolonged storage up to 24 weeks in ethanol, water, sodium chloride and RNAlater did not affect the subsequent MALDI-TOF-based identification of Taenia parasites, whereas formalin storage impeded later identification due to protein degradation. With regard to BSI diagnostics, it was shown that MALDI-TOF MS combined with the FAST™ System device enabled a correct and reliable identification of PBC samples. Indeed, in comparison to the reference technique, diagnostic agreement rates of 97.4% (150/154) and 95.7% (67/70) were observed for Gram-positive and Gram-negative pathogens, respectively. Subsequently, when compared to the routine workflow, the FAST™ System LC indicated AST results with a categorical agreement (CA) of 96.1% and 98.7% for MicroScan and disk diffusion, respectively. The turnaround time for correct identification and AST was significantly reduced by one day as compared to the standard methods.
Conclusion: MALDI-TOF MS can successfully be employed as a rapid and accurate diagnostic tool for identification of helminth parasites such as Fasciola spp., Schistosoma spp. or T. saginata. However, the creation and validation of an in-house library containing species-specific MSPs is necessary as no commercial database for parasite identification is available thus far. With regard to bacterial BSI, the herein presented results show that the FAST™ LC System allows to speed up the diagnostic process of PBC by reducing significantly the time to correct identification and AST results as compared to the reference method. Einleitung: Parasitäre Helminthen-Infektionen und bakterielle Blutstrominfektionen (BSI) sind große Gesundheitsprobleme, von denen Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Helminthische Parasiten kommen hauptsächlich in tropischen und subtropischen Gebieten vor, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, wo schlechte sanitäre und hygienische Bedingungen die Krankheitsübertragung und das Infektionsrisiko erhöhen können. Die meisten Helmintheninfektionen (z. B. Taeniasis, Schistosomiasis, Ascariasis, Trichuriasis und Hakenwurminfektionen) gehören zu den so genannten vernachlässigten Tropenkrankheiten („neglected tropical diseases“; NTD) und führen hauptsächlich zu einer chronischen Krankheitslast mit z.B. chronischem Durchfall, Wachstumsstörungen oder Anämie. Im Gegensatz dazu sind BSI akute, lebensbedrohliche Ereignisse und zeichnen sich durch das Vorhandensein von bakteriellen Erregern oder Pilzen im Blut aus. Die mikrobiologische Routinediagnostik von BSI und Helminthen stützt sich hauptsächlich auf Blutkulturen bzw. die mikroskopische Untersuchung von Parasiteneiern. Beide Techniken haben Einschränkungen, z. B. in Bezug auf die diagnostische Genauigkeit, und es besteht die Notwendigkeit, die Labornachweisverfahren zu verbessern. Durch die Entwicklung neuerer Techniken wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Matrix-assistierten Laser-Desorption/Ionisations- Flugzeit- (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) stehen bereits zahlreiche neue Ansätze zur Verfügung. Die MALDI-TOF-MS hat sich in vielen Laboren, vor allem in Ländern mit hohem Einkommen, zur Hauptidentifikationsmethode für die Bakteriendiagnostik entwickelt. Ziel dieser Arbeit ist es, die Anwendbarkeit innovativer MALDI-TOF MS-Ansätze zur Verbesserung der Diagnostik von Helminthen-Infektionen und BSI in verschiedenen Szenarien zu untersuchen und zu bewerten. Methoden: MALDI-TOF MS wurde zur Identifizierung verschiedener Helminthen eingesetzt, indem eine interne Datenbank mit Proteinspektrumsprofilen (Referenzspektren, auch bekannt als „main spectra profile“; MSP) erstellt wurde, welche aus Proteinextrakten gewonnen wurden, die je nach Größe aus einem Teil des Wurms oder dem gesamten Wurm stammen. Adulte Trematoden wurden gewonnen (Fasciola gigantica und F. hepatica, isoliert von geschlachteten Rindern in Nigeria bzw. der Schweiz; Schistosoma mansoni und S. japonicum, isoliert von Versuchsmäusen in Japan) und ebenso wie Zestoden (Taenia saginata Proglottiden, isoliert von Stuhlproben infizierter Patienten in der Schweiz) mittels MALDI-TOF MS zur Speziesbestimmung analysiert. Anschließend wurde die Auswirkung verschiedener Probenlagerungsmedien (z.B. Ethanol, Natriumchlorid, Formalin oder RNAlater) auf die Spektrenqualität und die diagnostische Genauigkeit untersucht. In einem zweiten Abschnitt der vorliegenden Promotionsarbeit wurde eine Validierung des kommerziell erhältlichen FAST™-Systems für eine verbesserte und schnellere MALDI TOF-basierte BSI-Identifizierung durchgeführt. Das System ermöglicht die Aufreinigung von Mikroorganismen in Patientenblutproben ohne einen ansonsten notwendigen Schritt einer Subkultur auf Agarmedien, indem eine sogenannte Flüssigkolonie gewonnen wird („Liquid Colony“; LC). Die LC-basierte MALDI-TOF MS wurde mit der Referenzmethode, die auf Agar-gewachsenen Kolonien basiert, verglichen, indem 261 positive Blutkulturproben von verschiedenen Stationen des Universitätsklinikums des Saarlandes in Homburg prospektiv analysiert wurden. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse einer Antibiotika-Resistenztestung aus der LC mit dem Referenzstandard verglichen (d. h. Mikrodilution mittels MicroScan WalkAway und direkt inokulierte Agarplättchen-Diffusionstestung). Ergebnisse: Die Helminthen-Untersuchungen ergaben, dass adulte Trematoden (Fasciola spp. und Schistosoma spp.) und Cestoden (T. saginata) mit MALDI-TOF MS zuverlässig identifiziert werden können, wobei die Identifizierungsraten zwischen 98,7% und 100% für Fasciola spp., 81% (Speziesidentifikation) und 100 % (Gattungsidentifikation) für Schistosoma spp., und zwischen 97,2% und 99,7% für T. saginata lagen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine längere Lagerung von bis zu 24 Wochen in Ethanol, Wasser, Natriumchlorid und RNAlater die anschließende MALDI-TOF-basierte Identifizierung von Taenia-Parasiten nicht beeinträchtigt, während die Lagerung in Formalin eine spätere Diagnostik aufgrund des Proteindenaturierung unmöglich macht. Im Hinblick auf die BSI-Diagnostik konnte gezeigt werden, dass MALDI-TOF MS in Kombination mit dem FAST™ System eine korrekte und zuverlässige Identifizierung von positiven Blutkultur-Proben ermöglicht. So wurden im Vergleich zur Referenztechnik diagnostische Übereinstimmungsraten von 97,4% (150/154) und 95,7% (67/70) für grampositive bzw. gramnegative Erreger festgestellt. Im Vergleich zum Routine-Workflow zeigte das FAST™ System LC Antibiotika-Resistenztestungsergebnisse mit einer kategorischen Übereinstimmung („categorical agreement; CA“) von 96,1% bzw. 98,7% für MicroScan und Agardiffusion. Die benötigte Zeit bis zur korrekten Identifizierung wurde im Vergleich zu den Standardmethoden deutlich um etwa einen Tag verkürzt. Schlussfolgerung: MALDI-TOF MS kann erfolgreich als schnelles und genaues Diagnoseinstrument zur Identifizierung von Helminthen wie Fasciola spp., Schistosoma spp. oder T. saginata eingesetzt werden. Allerdings ist die Erstellung und Validierung einer laboreigenen Datenbank mit speziespezifischen MSP erforderlich, da bisher keine kommerzielle Datenbank zur Parasitenidentifizierung zur Verfügung steht. In Bezug auf bakterielle BSI zeigen die hier vorgestellten Ergebnisse, dass das FAST™ LC-System die Diagnostik bei positiven Blutkulturen verbessern kann, indem es die Zeit bis zur korrekten Identifizierung und die Resistenztestungsergebnisse im Vergleich zur Referenzmethode erheblich verkürzt. |
Link zu diesem Datensatz: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-436526 hdl:20.500.11880/39204 http://dx.doi.org/10.22028/D291-43652 |
Erstgutachter: | Becker, Sören |
Tag der mündlichen Prüfung: | 28-Nov-2024 |
Datum des Eintrags: | 16-Dez-2024 |
Fakultät: | M - Medizinische Fakultät |
Fachrichtung: | M - Infektionsmedizin |
Professur: | M - Prof. Dr. Sören Becker |
Sammlung: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
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