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doi:10.22028/D291-43558
Titel: | The role of membrane property sensors and lipid fingerprints in endoplasmic reticulum stress and beyond |
VerfasserIn: | Reinhard, John Matthias |
Sprache: | Englisch |
Erscheinungsjahr: | 2024 |
Erscheinungsort: | Homburg/Saar |
DDC-Sachgruppe: | 500 Naturwissenschaften 570 Biowissenschaften, Biologie 610 Medizin, Gesundheit |
Dokumenttyp: | Dissertation |
Abstract: | Biological membranes are complex assemblies of lipids and proteins. They constitute unique environments for diverse and essential cellular functions. The membrane-bound organelles of eukaryotes are specialized compartments for biochemical reactions, featuring characteristic membrane compositions. These membrane lipid compositions are crucial for organellar identity and they are maintained despite physical contact to other organelles and constant exchange of molecular components. The yeast Saccharomyces cerevisiae is an established eukaryotic model organism, its lipid metabolism has been studied in great detail. Hence, it is well suited to study the effect of different cellular stress conditions on the lipid composition and collective properties of membranes. The unfolded protein response (UPR) and the OLE pathway are homeostatic programs that regulate cellular protein and lipid biogenesis. Both pathways depend on signal transduction from endoplasmic reticulum (ER) transmembrane proteins that sense collective biophysical membrane properties. How these collective properties emerge from the protein and lipid composition of a complex biomembrane, however, is not understood. Membrane aberrancies, such as increased levels of saturated lipid acyl chains, along the secretory pathway and the endosomal-lysosomal-system, contribute substantially to conditions of cellular stress and pathology.
The publications that constitute this cumulative thesis are centered around two central questions: I) What are the molecular sensing mechanisms of membrane property sensors? II) What is the effect of cellular stress on the membrane composition of individual organelles?
To answer these questions, I studied the transmembrane architecture of the UPR-activating protein Ire1. By in vitro crosslinking experiments, in the complex environment of isolated membrane vesicles, and in vivo fluorescence microscopy, we could show that Ire1's transmembrane domain adopts an X-shaped dimer conformation, independent of the stress-inducing condition. To better understand how biophysical membrane properties are sensed by proteins, I contributed to investigate the ER membrane protein Mga2, a lipid saturation sensor that relies on helix-helix rotations of its transmembrane domain. It regulates the abundance of saturated and unsaturated fatty acyl chains in membrane lipids. Against the common hypothesis, that lipid saturation mainly regulates membrane fluidity, our data suggest that Mga2 is sensitive to increased membrane packing density at a defined depth of the hydrophobic membrane core, and not to membrane fluidity.
To elucidate which membrane aberrancies lead to acute and chronic UPR activation, we must quantify the molecular composition of the ER membrane under diverse stress conditions. Chronic ER stress is tightly associated with complex metabolic diseases. The broad regulatory capacity of the UPR, affecting many genes of lipid metabolism, implies a key role of ER stress and UPR activity in membrane biogenesis and the regulation of lipid metabolism. The analysis of quantitative lipidomics data revealed that, under certain acute ER stress conditions, the cellular lipid composition was not substantially altered. However, whole cell lipidome data does not allow conclusions on the composition of the ER membrane, which is decisive for the activation of the membrane property sensors Ire1 and Mga2. To gain subcellular resolution for our quantitative lipidomics analyses, and thereby build a connection between aberrant organelle membrane compositions and molecular sensing mechanisms, I developed the novel membrane isolation technique MemPrep. With MemPrep, we could elucidate the molecular fingerprints of prolonged proteotoxic and lipid bilayer stress. Based on these data, we identified a contribution of membrane thickness and membrane surface charge density to the oligomerization of Ire1 and UPR activation. Furthermore, I adapted MemPrep to determine the lipid composition of the vacuole membrane. Upon nutrient limitation, the vacuole membrane undergoes phase separation into different coexisting liquid membrane domains. We could show that the phase separating vacuole membrane contains increased levels of phosphatidylcholine lipids with high melting temperatures. These can contribute to the formation of liquid membrane domains with high acyl chain order. Our data presents, for the first time, the lipid composition of a phase separating complex biomembrane, in a physiologically relevant context.
Ire1 and Mga2 are evolutionarily optimized sensors that ensure homeostasis of collective biophysical membrane properties. My work demonstrates that the lipid composition and collective membrane properties of the ER and the vacuole membrane are context dependent. However, maintaining physiological membrane functions and organelle identities is crucial for cellular survival. Biologische Membranen sind zelluläre Strukturen mit einer komplexen Zusammensetzung aus Lipiden und Proteinen. Sie bilden lebenswichtige Barrieren und einzigartige Umgebungen für vielfältige und essenzielle zelluläre Funktionen. Organellen von Eukaryoten bilden spezialisierte Reaktionsräume mit charakteristischen Membrankompositionen. Diese Kompositionen sind von enormer Bedeutung für die Identität von Organellen und werden aufrechterhalten, trotz physikalischem Kontakt zu anderen Organellen und ständigem Austausch von molekularen Komponenten. Saccharomyces cerevisiae ist ein etablierter eukaryotischer Modellorganismus dessen Lipidmetabolismus gut erforscht ist. Er ist daher gut geeignet, um den Effekt von verschiedenen zellulären Stressbedingungen auf die Membranzusammensetzung und biophysikalischen Eigenschaften der Organellen zu untersuchen. Die unfolded protein response (UPR) und der OLE pathway sind homöostatische Programme, welche die zelluläre Proteinbiogenese und den Lipidstoffwechsel regulieren. Beide Signalwege hängen von Transmembranproteinen des endoplasmatischen Retikulums (ER) ab, die biophysikalische Membraneigenschaften als Eingangssignale wahrnehmen und verarbeiten. Aktuell verstehen wir nicht, wie kollektive Membraneigenschaften aus den Protein- und Lipidzusammensetzungen von komplexen Biomembranen entstehen. Veränderungen dieser Kompositionen, wie zum Beispiel ein erhöhter Sättigungsgrad von Lipid Acylketten in Membranen des sekretorischen Weges und des endosomalen und lysosomalen Systems, tragen entscheidend zu zellulärem Stress und pathologischen Konditionen bei. Dieser kumulativen Dissertation liegen Publikationen zu Grunde, die durch zwei zentrale Fragen miteinander verknüpft sind: I) Was sind die molekularen Mechanismen der Sensoren von Membraneigenschaften? II) Welchen Einfluss hat zellulärer Stress auf die Zusammensetzung der Membran einzelner Organellen? Zur Beantwortung dieser Fragen untersuchte ich zuerst die Transmembranarchitektur des UPR-aktivierenden Proteins Ire1. Durch Quervernetzungsexperimente in der komplexen Umgebung isolierter Membranvesikel und konfokale Fluoreszenzmikroskopie in vivo konnten wir zeigen, dass der Transmembranbereich von Ire1, unabhängig von der stressauslösenden Bedingung, eine X-förmige Konformation einnimmt. Um besser zu verstehen, wie biophysikalische Membraneigenschaften von Proteinsensoren erfasst werden, habe ich bei der Erforschung eines Lipid-Sättigungssensors mitgewirkt, dessen Sensitivität auf Helix-Helix Rotationen im Transmembranbereich beruht. Das ER-Protein Mga2 reguliert den Anteil von gesättigten und ungesättigten Acylketten in Membranlipiden. Entgegen der verbreiteten Lehrmeinung, dass der Sättigungsgrad von Lipiden vornehmlich zur Aufrechterhaltung der Membranfluidität dient, zeigten unsere Daten, dass Mga2 auf die Packungsdichte der Lipide in einer bestimmten Tiefe im hydrophoben Kern der ER Membran reagiert, und nicht auf die Fluidität der Membran. Um zu verstehen, welche Veränderungen in der ER Membran zu akuter und chronischer Aktivierung der UPR führen, muss der Einfluss von Stress auf die Zusammensetzung der ER Membran quantitativ analysiert werden. Chronischer ER Stress ist eng assoziiert mit komplexen metabolischen Erkrankungen. Die breite regulatorische Kapazität der UPR, welche eine Vielzahl von Genen des Lipidmetabolismus betrifft, impliziert eine Schlüsselrolle von ER Stress und UPR für die Membranbiogenese und die Regulation des Lipidstoffwechsels. Die Analyse quantitativer Lipidomdaten ergab, dass nach bestimmten akuten ER Stressbedingungen die Lipidzusammensetzung der Zelle nicht wesentlich verändert war. Ganzzell-basierte Lipidomdaten lassen jedoch keine Rückschlüsse auf die Lipidzusammensetzung der ER Membran zu, die für die molekularen Aktivierungsmechanismen der Sensoren Ire1 und Mga2 ausschlaggebend ist. Um bei quantitativen Lipidomanalysen eine subzelluläre Auflösung zu erreichen, und dadurch eine Verbindung zwischen veränderten Membranzusammensetzungen und molekularen Sensormechanismen herzustellen, entwickelte ich eine neuartige Methode zur Membranisolation, die MemPrep getauft wurde. Mit MemPrep konnten wir molekulare Signaturen von anhaltendem proteotoxischem und membranbasiertem Stress entschlüsseln. Basierend auf diesen Daten konnte eine Rolle der Membran-Dicke und Kompressibilität, sowie der Oberflächenladung auf die Oligomerisierung von Ire1 und Aktivität der UPR identifiziert werden. Darüber hinaus adaptierte ich MemPrep zur Isolation der Vakuolenmembran. Bei limitiertem Angebot an Nährstoffen findet dort eine Phasentrennung, unter der Bildung zwei koexistierender flüssiger Membrandomänen, statt. Wir konnten zeigen, dass die phasengetrennte Vakuolenmembran eine erhöhte Konzentration von Phosphatidylcholin mit hohem Schmelzpunkt aufweist. Dies könnte zu einer Phasenseparation von flüssigen Domänen mit hoher Acylkettenordnung beitragen. Damit beschrieben wir das erste Mal, für einen physiologisch relevanten Kontext, die Lipidzusammensetzung einer phasengetrennten komplexen Biomembran. Ire1 und Mga2 sind durch Evolution optimierte Sensoren, welche die Homöostase von biophysikalischen Membraneigenschaften sicherstellen. Meine Arbeiten zeigen: Die Lipidkomposition und die physikalischen Eigenschaften der ER- und Vakuolenmembran sind zwar abhängig vom zellulären Kontext, jedoch ist der Erhalt physiologischer Membranfunktionen und der Identität von Organellen von enormer Bedeutung für das Überleben von Zellen. |
Link zu diesem Datensatz: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-435586 hdl:20.500.11880/39122 http://dx.doi.org/10.22028/D291-43558 |
Erstgutachter: | Ernst, Robert |
Tag der mündlichen Prüfung: | 25-Nov-2024 |
Datum des Eintrags: | 5-Dez-2024 |
Fakultät: | M - Medizinische Fakultät |
Fachrichtung: | M - Medizinische Biochemie und Molekularbiologie |
Professur: | M - Prof. Dr. Robert Ernst |
Sammlung: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
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