Tetrazole Methylsulfone - Thiol crosslinked hydrogels for automated and high-throughput 3D cell culture

Abstract

The understanding of diseases and the development of personalized therapies relies on the predictive potential of 3D cell culture models. Automation of the culture steps is crucial, for which in situ crosslinked hydrogels with adequate and tunable kinetics under physiological conditions are needed to temporally replace the natural 3D matrix. This Thesis investigates hydrogels formed by tetrazol methylsulfone (TzMS) derivatized star-polyethylene glycol and thiol-crosslinkers for automated 3D cell encapsulation, including precursor synthesis scale-up, characterization of their crosslinking kinetics and mechanical properties, and their semi-automated preparation with pipetting robots. The optimization of reaction and purification conditions allowed for an upscaling to 0.6-g scale of polymer precursor. The gelation kinetics and mechanical properties of the hydrogels were studied as a function of precursors stoichiometry, crosslinker architecture, biofunctionalization degree and pH. Tunability of gelation time and stiffness at pH 7.0 – 8.0 was explored for a cell-compatible hydrogel composition including the cell-adhesive ligand RGD and the enzyme-cleavable peptide VPM as crosslinker. A semi-automated pipetting protocol was set up to prepare 5 µl hydrogels in a 384-well plate format, and statistical experimental design was used to systematically minimize variability. The results demonstrate the suitability and limitations of TzMS/thiol chemistry for in situ cell encapsulation.

Das Verständnis von Krankheiten und die Entwicklung personalisierter Therapien hängen von dem Fortschritt bei 3D-Zellkulturmodellen ab, bei denen in situ gebildete Hydrogele verwendet werden, um Zellen einzukapseln und die natürliche 3D-Matrix vorübergehend zu ersetzen. Von Vorteil sind Hydrogele mit kontrollierter Vernetzungskinetik, die in automatisierte Arbeitsabläufe implementiert werden können. Diese Dissertation befasst sich mit Hydrogelen, die aus Tetrazolmethylsulfon (TzMS)-derivatisiertem Stern-Polyethylenglykol mit kommerziellen thiolierten Vernetzern gebildet werden. Die bestehende fünfstufige Synthese und Aufreinigung der Hydrogel-Vorläufers wurde optimiert und hochskaliert. Die Vernetzungskinetik und mechanische Eigenschaften der Hydrogele wurden in Abhängigkeit von Stöchiometrie der Ausgangsstoffe, Vernetzerarchitektur, Biofunktionalisierungsgrad und pH-Wert untersucht. Die Einstellung von Vernetzungszeit und Steifigkeit wurden bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 für ein zellkompatibles Hydrogel mit dem zelladhäsiven Liganden RGD und dem enzymspaltbaren Peptid VPM als Vernetzer erforscht. Es wurde ein halbautomatisches Pipettierprotokoll für die Herstellung von 5 μl-Hydrogelen in einem 384-Well-Plattenformat erstellt, und die Variabilität mithilfe eines statistischer Versuchsplan systematisch minimiert. Die Ergebnisse zeigen die Eignung und die Grenzen der Thiol-TzMS-Chemie für die in situ Zellverkapselung.