A genome sequencing array for time and cost-effective familial hypercholesterolemia mutation analysis

Abstract

Introduction: Familial hypercholesterolemia (FH) is a frequently underdiagnosed condition that can lead to severe clinical consequences related to high LDL-C levels such as atherosclerotic cardiovascular disease, myocardial infarction, and stroke at an early age. To date, diagnosis is established using clinical scoring systems. Since FH is often caused by dominant mutations in genes involved in lipid metabolism, genetic testing of relevant genes is an important complementary measure to diagnose FH. Testing with next generation sequencing (NGS) is a robust and accurate method, however cost intensive. Genotyping with a DNA microarray may provide a cost-effective alternative. Methods: In the study presented here, a new custom DNA microarray was designed to allow for detection of the most common mutations described in FH. It contained a total of 45298 SNPs located in genes involved in the lipid metabolism. A total of 70 patients with suspected FH were tested with the microarray, and additionally with two different clinical testing systems, the Simon Broom and the Dutch Lipid Clinic Network Score (DLCNS). Validation with NGS was performed in 13 patients. Results: Eight of the 70 patients were positive for mutations according to the microarray. Sensitivity of the DNA microarray was 14%, 22%, and 40%, negative predictive value was 23%, 55% and 33.3%, when the Simon Broom, DLCNS and NGS were considered the gold standard, respectively. Specificity and positive predictive value were in all cases 100%. From the 13 patients tested with NGS, in 10 a pathologic mutation was found. Two patients had concordant mutations in NGS and microarray testing. In two patients, the NGS and microarray found different mutations. In four patients which tested positive in the assay, no mutation was found by NGS. In six patients in which no mutation was found by microarray, a pathogenic mutation was found by NGS. No patient which was considered “unlikely” to suffer from FH according to scoring was found to be positive in genetic testing. The cost of the microarray and NGS tests were estimated at 40-50€ and 500-1000€ per patient. Conclusion: The genetic diagnosis of FH could be made reliably using a custom DNA microarray and at a fraction of the cost of NGS with remarkable specificity. However, false negatives are a relevant problem, and an additional diagnostic test is required to confirm negativity for monogenic FH in case of strong clinical suspicion. The Simon Broom and DLCNS criteria can reliably identify patients in whom genetic testing is unnecessary. In patients scoring “possible” or “probable” for FH according to clinical scores, a two step approach involving first testing with microarray and repeat testing with NGS on patients who tested negative initially would results in reduced costs compared to upfront NGS testing for all patients. Furthermore, a DNA microarray would be useful for genetic FH diagnosis in a low-resource setting

Zusammenfassung Familiäre Hypercholesterinämie (FH) ist eine häufig unterdiagnostizierte Erkrankung, die aufgrund hoher LDL-C-Werte zu schwerwiegenden klinischen Folgen wie atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Myokardinfarkt und Schlaganfall in jungen Jahren führen kann. Bis heute wird die Diagnose anhand verschiedener klinischer Bewertungssysteme gestellt, die Punkte basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen klinischer und anamnestischer Zeichen und Symptome vergeben. Diskrepanzen in den Ergebnissen dieser Bewertungssysteme zeigen, dass es bei der aktuellen FH-Diagnose noch Verbesserungsbedarf besteht. Da FH häufig durch dominante Mutationen in einem der am Lipidstoffwechsel beteiligten Gene verursacht wird, könnten Gentests im Vergleich zur herkömmlichen klinischen Bewertung eine genauere Möglichkeit zur Diagnose von FH bieten oder zumindest eine ergänzende Maßnahme zur Erklärung klinischer Anzeichen und Symptome für Mutationen darstellen, deren biologische Auswirkungen noch nicht genau geklärt sind. In der hier vorgestellten Studie wurde ein neuer DNA-Array namens „CARdioRENAL“ (CARRENAL)-Array entwickelt, um den Nachweis der häufigsten bei FH beschriebenen Mutationen zu ermöglichen. Er enthielt insgesamt 42615 SNPs, die in Genen lokalisiert waren, die am Lipidstoffwechsel beteiligt sind. Der Array wurde verwendet, um 70 Patienten mit Verdacht auf FH zu testen. Zusätzlich wurden die Patienten mit zwei verschiedenen klinischen Testsystemen getestet, nämlich den Simon-Broom-Kriterien und dem Dutch Lipid Clinic Network Score. 8 der 70 Patienten waren positiv für Mutationen gemäß dem CARRENAL-Array. Unter Verwendung der klinischen Bewertungsskala wurden einige, aber nicht alle dieser acht Patienten mit einem der beiden klinischen Bewertungssysteme als eindeutige FH eingestuft. Der Rest der acht Patienten wurde mit den beiden klinischen Bewertungen jeweils als „wahrscheinliche FH“ bewertet. Während sowohl die Simon-Broom-Kriterien als auch der Dutch Lipid Clinic Network Score mehrere Patienten fanden, bei denen das Vorliegen einer FH als unwahrscheinlich galt, war bei Verwendung des CARRENAL-Arrays keiner dieser Patienten positiv. Der Vergleich zwischen den CARRENAL-Daten und der DNA-Sequenzierung zeigte mehrere Diskrepanzen, die in einer zukünftigen Studie untersucht werden sollten.