Rolle von extrazellulären Vesikeln für die Resistenzinduktion in Nierenzellkarzinomen unter Behandlung mit Pazopanib

Abstract

Maligne Nierentumoren sind in Deutschland unter den zehn häufigsten Tumorentitäten zu finden [53]. Da Patienten mit Fernmetastasen nach durchschnittlich 6 bis 15 Monaten eine Resistenz gegen Tyrosinkinaseinhibitoren als Bestandteil der systemischen Therapie entwickeln, ist es von großem Interesse, die Mechanismen der Resistenzentwicklung zu verstehen. Zellen kommunizieren über kleine extrazelluläre Vesikel, sog. Exosomen, miteinander und können so DNA, RNA, Lipide, Proteine und Kohlenhydrate austauschen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Exosomen eine Resistenz gegen den Tyrosinkinaseinhibitor Pazopanib übertragen können. Die verwendete Pazopanib-resistente Zelllinie 786-OPR weist bei ansteigender Pazopanibkonzentration (7 – 22 μM) dauerhaft eine höhere Zellviabilität als die sensitive Zelllinie 786-OWT auf und zeigt eine deutlich erhöhte IC50. Sowohl die Exosomen von 786-OWT als auch die Exosomen von 786-OPR exprimieren in Immunoblot-Analysen CD63 und Syntenin als exosomale Marker. In NTA-Messungen weisen die Exosomen eine durchschnittliche Größe zwischen 115 und 132 nm auf, insgesamt sezernieren 786-OPR-Zellen mehr Exosomen als 786-OWT. Fluoreszenzgefärbte Exosomen von 786-OPR werden in sensitive 786-OWT-Zellen aufgenommen. Durch die Stimulation von sensitiven Zellen mit Exosomen von 786-OPR kann die Zellviabilität unter Behandlung mit Pazopanib von 17,9% (PBS-Kontrolle) auf maximal 33,5% (8 μg/ml 786-OPR-Exosomen) gesteigert werden (p = 0,995). Die Erhöhung der Zellviabilität kann auch durch Stimulation der Zellen mit Exosomen von 786-OWT erreicht werden, der Effekt ist allerdings weniger stark ausgeprägt (maximal 20,3% nach Stimulation mit 8 μg/ml 786-OWT-Exosomen, p = 1,0). Eine Stimulation mit 786-OPR-Exosomen resultiert in einer generellen Steigerung der Zellviabilität von 100% (PBS-Kontrolle) auf maximal 159,8% (8 μg/ml 786-OPR-Exosomen) unter Behandlung mit DMSO (p = 0,026). 786-OPR-Zellen zeigen eine verstärkte Expression von Axl/c-MET im Vergleich zu den sensitiven Zellen als Hinweis auf eine mögliche Hochregulation eines alternativen Pathways zur Zellproliferation. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sensitive 786-O-Zellen durch Stimulation mit Exosomen resistenter 786-O-Zellen eine höhere Toleranz gegen eine Behandlung mit dem Tyrosinkinaseinhibitor Pazopanib aufweisen. Um die beobachteten Effekte auf das Zellüberleben in kausalem Zusammenhang mit einer Exosomenstimulation bringen zu können, müssen sich weitere Experimente anschließen. Eine genauere Charakterisierung des Inhalts der Exosomen sensitiver und resistenter 786-O-Zellen kann zur Klärung der Resistenzentwicklung beitragen. Da es zahlreiche zelluläre Pathways zur Zellproliferation und zum Zellüberleben gibt, ist die Entdeckung eines singulären Übertragungsmechanismus unwahrscheinlich. Vielmehr ist eine Kombination aus mehreren molekularen Mechanismen denkbar, wobei nicht nur Exosomen eine Rolle spielen.

Renal malignancies are to be found amongst the ten most prevalent cancers in Germany [53]. As patients treated with systemic therapy usually develop resistances against the widely used tyrosine kinase inhibitors after about 6 to 15 months of treatment, it is of great interest to further investigate the mechanisms behind developing resistances against targeted therapy [143]. Exosomes as means of intercellular communication serve to exchange DNA, RNA, lipids, proteins and carbohydrates between cells [79,178]. This doctoral thesis sought to explore whether or not exosomes could transfer a resistance against the tyrosine kinase inhibitor Pazopanib. 786-OPR (Pazopanib-resistant ccRCC-cells) constantly display a higher cell viability while being exposed to rising concentrations of Pazopanib (7 – 22 μM) in comparison to Pazopanib-sensitive 786-OWT cells and also present to have a higher IC50. Exosomes of both 786-OWT and 786-OPR express exosomal markers such as CD63 and Syntenin in western blot analysis. Nanoparticle tracking analysis showed the average size of exosomes to be ranging between 115 and 132 nm. In addition to that, 786-OPR produces far more exosomes than 786-OWT. The stimulation of sensitive 786-OWT cells with 8 μg/ml exosomes derived from 786-OPR leads to an increase in cell viability from 17.9% up to 33.5% when cells are treated with Pazopanib after stimulation (p = 0.995). Slight increases in cell viability can also be achieved by stimulating 786-OWT cells with their own exosomes, even though the effect is not as strong with a maximum of 20.3% cell viability after stimulation with 8 μg/ml 786-OWR exosomes (p = 1.0). If cells are treated with DMSO, stimulation of 786-OWT cells with exosomes derived from 786-OPR results in rising the cell viability up to 159.8% compared to the cell viability of cells stimulated with PBS only (100%, p = 0.026). 786-OPR cells show increased expression of Axl/c-MET, which might indicate a possible upregulation of alternative pathways stimulating cell proliferation. The results of this thesis indicate that exosomes derived from TKI-resistant cells alter the cell viability of sensitive cells. To further investigate the observed impact of exosomes on the survival and proliferation and draw causal linkage between stimulation with exosomes and increase in cell viability, further experiments have to follow up. Additional characterization of exosomes and their cargo could contribute to explaining the development of resistance. Since there are several pathways regulating cell proliferation and survival, it is highly unlikely to be one single mechanism responsible for developing resistances. Rather it should be taken into consideration that a combination of several molecular mechanisms is involved.