Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the high-value active ingredient 5-hydroxyectoine

Abstract

Microbes produce the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine, small L-aspartate derived organic molecules, to cope with environmental stresses like high osmolarity, drought, and heat. Thereby, the molecules accumulate at high concentration in the cytosol, actively stabilizing macromolecules and cellular structures without interfering with biological functionality. Consequently, they are of interest as active ingredients for pharmaceutics and cosmetics. Ectoine is already produced biotechnologically in industrial scale and broadly applied. For hydroxyectoine however a feasible production process could not be established to this day. In the first section of this work Corynebacterium glutamicum was metabolically engineered to produce hydroxyectoine via bioconversion of externally supplied ectoine. Codon-optimized ectoine hydroxylase genes (ectD) from 16 phylogenetically diverse donors were screened for their performance in C. glutamicum. The superior ectD variant from Pseudomonas stutzeri, together with optimized cultivation conditions led to a bioconversion process yielding 74 g/L of hydroxyectoine at 70% selectivity in a simple batch fermentation. In a second attempt the previously published strain C. glutamicum ECT-2 was metabolically engineered to produce hydroxyectoine de novo. The finally designed ECT-8D strain revealed superior production performance. Within 19 h it delivered 28 g/L of hydroxyectoine with 93% selectivity from sucrose in a fed-batch process.

Mikroorganismen produzieren die L-Aspartat-Derivate Ectoin und Hydroxyectoin als kompatible Solute, um sich vor externen Belastungen wie hoher Osmolarität, Trockenheit und Hitze zu schützen. Die Moleküle reichern sich in hoher Konzentration im Zytosol an und stabilisieren aktiv Makromoleküle und Zellstrukturen, ohne biologische Funktionen zu beeinträchtigen. Daher sind sie als Wirkstoffe in Pharmazie und Kosmetik von Interesse. Ectoin wird bereits biotechnologisch im industriellen Maßstab hergestellt und findet breite Anwendung. Für Hydroxyectoin konnte bisher jedoch keine wirtschaftliche Produktion etabliert werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde Corynebacterium glutamicum genetisch so verändert, dass es Hydroxyectoin durch Biokonversion von supplementiertem Ectoin produziert. Codon-optimierte Ectoinhydroxylase-Gene (ectD) von 16 phylogenetisch verschiedenen Donoren wurden auf ihre Leistung in C. glutamicum untersucht. Die beste ectDVariante aus Pseudomonas stutzeri, zusammen mit optimierten Kultivierungsbedingungen, führte zu 74 g L-1 Hydroxyectoin bei 70% Selektivität in einer einfachen Batch-Fermentation. In einem zweiten Ansatz wurde der bereits veröffentlichte Stamm C. glutamicum ECT-2 genetisch so verändert, dass er Hydroxyectoin de novo produziert. Der final entwickelte Stamm ECT-8D zeigte eine überragende Produktionsleistung. Innerhalb von 19 Stunden lieferte er 28 g L-1 Hydroxyectoin mit 93% Selektivität aus Saccharose in einem Fed-Batch- Prozess.