Der Einfluss von ADAM10 und dessen Modulatoren sowie von Methylxanthinen auf die molekularen Mechanismen, die zur Alzheimer-Erkrankung führen, insbesondere durch Veränderung der Lipidhomöostase und Genexpression

Abstract

Die Alzheimer-Erkrankung stellt heutzutage die häufigste Form der Demenz dar. Die sekundär daraus resultierenden Folgeerkrankungen bilden eine der häufigsten Todesursachen in Industrienationen. Weltweit leiden Millionen von Menschen an dieser neurodegenerativen Erkrankung, welche unter anderem durch den Verlust von Neuronen, eine hippocampale Atrophie, intrazelluläre Ansammlung von Tau-Fibrillen, einen erhöhten oxidativen Stress-Level, eine veränderte Lipidzusammensetzung und extrazelluläre Amyloid-β-Plaques gekennzeichnet ist. Durch die proteolytische Aktivität der β- und γ-Sekretase kommt es zur sequenziellen amyloidogenen Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins und zur Bildung und Akkumulation extrazellulärer amyloider Plaques, welche ein Charakteristikum in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung darstellen. Durch die proteolytische Spaltung von APP innerhalb der Aβ-Sequenz mittels α-Sekretasen kann die Ablagerung der charakteristischen Amyloid-Plaques verhindert werden. Aufgrund der Tatsache, dass es sich sowohl beim Amyloid-Vorläuferprotein als auch bei den proteolytischen Enzymen um Transmembranproteine handelt, ist eine Beeinflussung der Prozessierung durch die Lipidumgebung zu vermuten. ADAM10 konnte als ein Hauptvertreter der α-Sekretase-Familie identifiziert werden, dessen Bedeutung an der nicht-amyloidogenen Prozessierung vom Amyloid-Vorläuferprotein mittelweile wissenschaftlich belegt ist. Als Typ-I-Transmembranprotein ist es in die Plasmamembran aller Zellen integriert und steht somit in unmittelbarer Beziehung zur Lipidzusammensetzung der Zelle. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwiefern das Fehlen von ADAM10 Auswirkungen auf den Lipidmetabolismus von Phospholipiden, Acetyl- und Acyl-Carnitinen und Triglyceriden in HEK-Zellen hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Knockout von ADAM10 eine massive Verschiebung der Lipidzusammensetzung zur Folge hatte. Aufgrund einer signifikanten Erhöhung der Lyso-Phosphatidylcholin-Spezies und gleichzeitiger signifikanter Reduzierung der Phosphatidylcholin- und Plasmalogen-Spezies könnte eine verstärkte Phospholipase A2-Aktivität, deren Beteiligung an der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung diskutiert wird, bedingt durch den ADAM10-Knockout, angenommen werden. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es bis dato keine kausale Therapie der Alzheimer-Erkrankung. Aus diesem Grund ist die Prävention der Erkrankung weiterhin von großer Bedeutung. Da sich eine gezielte Inhibition der β- oder γ-Sekretase als nicht erfolgsversprechend herausgestellt hat und eine Aβ-Antikörperbehandlung noch weiterführend in klinischen Studien beurteilt werden muss, könnten etablierte Medikamente oder Substanzen, die eine ADAM10-aktivierende Wirkung entfalten, eine Option in der Behandlung der Erkrankung darstellen. Sowohl die beiden Medikamente Gemfibrozil und Tamibarotene als auch der sekundäre Pflanzenstoff Epigallocatechin-3-gallat erfüllen diese Eigenschaften. In der vorliegenden Arbeit konnte der positive Einfluss von Tamibarotene und Epigallocatechin-3-gallat auf ADAM10 in Nerven-, Nieren- und Lungenzellen nachgewiesen werden. Bezüglich der Lipidzusammensetzung in Nerven-, Nieren- und Lungenzellen zeigten sich Unterschiede zwischen beiden Substanzen. Dabei konnte für Epigallocatechin-3-gallat keine negative Beeinflussung der Lipidzusammensetzung beobachtet werden, es zeigte sich sogar ein für die Alzheimer-Erkrankung präventiver Trend in der Zusammensetzung der Phospholipide. Tamibarotene hingegen wies sowohl in Nieren- als auch in Nervenzellen teilweise signifikante Veränderungen in der Lipidzusammensetzung auf, weshalb die Verschreibung dieses Medikaments mit Vorsicht betrachtet werden sollte. Gemfibrozil wird als Triglycerid-senkendes Medikament seit 40 Jahren angewandt. Als Ligand für den Peroxisom-Proliferator-Aktivator-Rezeptor α induziert es die Transkription zahlreicher Gene für den Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsel und hat darüber hinaus auch transkriptionellen Einfluss auf die Expression von ADAM10. Jedoch ist bisher nicht bekannt, inwiefern Gemfibrozil die intrazelluläre Lipidhomöostase beeinflusst. Um dieser Frage nachzugehen, wurden sowohl Nerven- als auch Nieren- und Lungenzellen mit Gemfibrozil inkubiert und anschließend deren Lipidzusammensetzung analysiert. Dabei konnte in allen drei untersuchten Zellreihen ein starker Anstieg der intrazellulären Triglycerid-Spiegel beobachtet werden, was auf eine verbesserte intrazelluläre Aufnahme derer zurückzuführen sein könnte. Neben dem generellen Anstieg der Triglyceride konnten zelllinienspezifische Veränderungen in der Acylcarnitin-Zusammensetzung beobachtet werden. Diese Ergebnisse könnten daraufhin deuten, dass Gemfibrozil in Nervenzellen den Transport von Fettsäuren in die Mitochondrien erhöht und dadurch der Umsatz von Fettsäuren in zusätzliche Energie für die Zelle gesteigert wird. Dies könnte speziell für die Alzheimer-Erkrankung, in der ein generelles Energiedefizit besteht, von Bedeutung sein. Methylxanthine sind in unserer Ernährung und als Pharmazeutika weit verbreitet. Es handelt sich um eine Stoffgruppe, die sich von der Purinbase Xanthin ableitet und unterschiedliche Methylgruppenzusammensetzungen aufweist. Ihre positiven Eigenschaften bei neurodegenerativen Erkrankungen wurden in den letzten Jahren intensiv erforscht. Dabei konnten für die Xanthin-Derivate Koffein, Theobromin, Theophyllin, Pentoxifyllin und Propentofyllin mehrere präventive molekulare Mechanismen identifiziert werden. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass diese den Amyloid-β-Spiegel reduzieren, indem sie die nicht-amyloidogene Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins intensivieren. Koffein führte dabei zu einer ADAM10-Proteinstabilitätszunahme, zu einer Reduzierung der β-Sekretase-Expression und einer direkten Verringerung der γ-Sekretase-Aktivität. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt der fünf aufgeführten Methylxanthine auf die Transkriptionsregulation verschiedener Gene, die mit der Alzheimer-Erkrankung in Verbindung stehen, untersucht. Die untersuchten Gene konnten dabei, je nachdem in welchen Signal- oder Stoffwechselweg sie involviert sind, in Prozesse wie oxidativen Stress, Lipid- und Energiemetabolismus, Signaltransduktion, Transkriptionsregulation und neuronale Funktionswege gegliedert werden. Interessanterweise ergab die Untersuchung eine Alleinstellung des Methylxanthins Koffein verglichen zu den anderen vier untersuchten Xanthin-Derivaten, was auf eine besondere Rolle von Koffein bei der Genregulation Alzheimer-relevanter Gene hindeutet.

1.2 The influence of ADAM10 and its modulators, as well as methylxanthines, on the molecular mechanisms leading to Alzheimer's disease, particularly by altering lipid homeostasis and gene expression Alzheimer's disease is the most common form of dementia today. The secondary resulting diseases are one of the most frequent causes of death in industrialized nations. Millions of people worldwide suffer from this neurodegenerative disease, which is characterized, among other factors, by the loss of neurons, hippocampal atrophy, intracellular accumulation of tau fibrils, increased oxidative stress levels, altered lipid composition, and extracellular amyloid-β plaques. Proteolytic activity of β- and γ-secretase results in sequential amyloidogenic cleavage of amyloid precursor protein and the formation and accumulation of extracellular amyloid plaques, which are a feature in the pathogenesis of Alzheimer’s Disease. Proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein within the Aβ-sequence by α-secretases can prevent the deposition of the characteristic amyloid plaques. Due to the fact that both the amyloid precursor protein and the proteolytic enzymes are transmembrane proteins, an influence of the processing by the lipid environment can be suspected. ADAM10 has been identified as a major member of the α-secretase family whose importance in the non-amyloidogenic processing of amyloid precursor protein is now scientifically established. As a type I transmembrane protein, it is integrated into the plasma membrane of all cells and is thus directly related to the lipid composition of the cell. This work addresses the question of how the absence of ADAM10 affects the lipid metabolism of phospholipids, acetyland acyl-carnitines, and triglycerides in HEK cells. Here, we demonstrated that knockout of ADAM10 resulted in a massive shift in lipid composition. Due to a significant increase of lysophosphatidylcholine species and a simultaneous significant reduction of phosphatidylcholine and plasmalogen species, an enhanced phospholipase A2 activity, whose involvement in the pathogenesis of Alzheimer's disease is discussed, could be assumed to be caused by the ADAM10 knockout. Despite decades of intensive research, there is still no causal therapy for Alzheimer's disease. For this reason, prevention of the disease remains of great importance. Since targeted inhibition of β- or γ-secretase has not proven promising and Aβ-antibody treatment still needs to be further evaluated in clinical trials, established drugs or substances that exert an ADAM10- activating effect could represent an option in the treatment of the disease. Both drugs gemfibrozil and tamibarotene as well as the secondary plant compound epigallocatechin-3- gallate fulfill these properties. In the present work, the positive influence of tamibarotene and epigallocatechin-3-gallate on ADAM10 in nerve, kidney, and lung cells was demonstrated. Regarding the lipid composition in nerve, kidney and lung cells, differences between both substances were shown. No negative effect on lipid composition was observed for epigallocatechin-3-gallate, and there was even a preventive trend for Alzheimer's disease in the composition of phospholipids. Tamibarotene, on the other hand, showed partially significant changes in lipid composition in both kidney and nerve cells, which is why the prescription of this drug should be considered with caution. Gemfibrozil has been used as a triglyceride-lowering drug for 40 years. As a ligand for the peroxisome proliferator activator receptor α, it induces transcription of numerous genes for carbohydrate and lipid metabolism and also has transcriptional influence on the expression of ADAM10. However, the extent to which gemfibrozil affects intracellular lipid homeostasis is not yet known. To address this question, nerve cells as well as kidney and lung cells were incubated with gemfibrozil and subsequently their lipid composition was analyzed. A strong increase in intracellular triglyceride levels was observed in all three cell series studied, which could be due to enhanced intracellular uptake of these. In addition to the general increase in triglycerides, cell line-specific changes in acylcarnitine composition were observed. These results may suggest that gemfibrozil in neurons increases the transport of fatty acids into mitochondria, thereby increasing the turnover of fatty acids into additional energy for the cell. This could be specifically relevant to Alzheimer's disease, in which there is a general energy deficit. Methylxanthines are widely used in our nutrition and as pharmaceuticals. They are a group of substances derived from the purine base xanthine and have different methyl group compositions. Their beneficial properties in neurodegenerative diseases have been intensively researched in recent years. Several preventive molecular mechanisms have been identified for the xanthine derivatives caffeine, theobromine, theophylline, pentoxifylline and propentofylline. For example, these were shown to reduce amyloid-β levels by intensifying nonamyloidogenic processing of the amyloid precursor protein. In this context, caffeine led to an ADAM10 protein stability increase, a reduction in β-secretase expression, and a direct reduction in γ-secretase activity. In the present work, the effect of the five listed methylxanthines on the transcriptional regulation of various genes associated with Alzheimer’s Disease was investigated. Depending on the signaling or metabolic pathway they are involved in, the genes studied could be categorized into processes such as oxidative stress, lipid and energy metabolism, signal transduction, transcriptional regulation, and neuronal functional pathways. Interestingly, the study revealed a sole position of the methylxanthine caffeine compared to the other four xanthine derivatives studied, suggesting a specific role of caffeine in gene regulation of Alzheimer-related genes.