Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-42463
Titel: Expression und Analyse von TRPV6 in humanen Trophoblastenzelllinien
VerfasserIn: Klawitter, Daniel Stefan
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2023
Erscheinungsort: Homburg / Saar
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumenttyp: Dissertation
Abstract: TRPV6 ist ein kalziumsensitiver Kationenkanal, der in serösen Drüsen und in Plazenta exprimiert wird. In der Schwangerschaft hat TRPV6 einen Einfluss auf den plazentaren Kalziumtransport, da sowohl bei Trpv6-defizienten Mäusen als auch bei Menschen, die bestimmte Trpv6-Genmutationen besitzen eine Untermineralisierung der Skelettknochen bei Embryonen und Neugeborenen festzustellen ist. Die feto-maternale Versorgung mit Nährstoffen und Mineralien erfolgt bei beiden Spezies über spezialisierte Zellen der Plazentaschranke, die Synzytiotrophoblasten, die das TRPV6 Protein exprimieren. In dieser Arbeit wurden die aus Chorionkarzinomen abgeleiteten Bewo- und JEG3-Zelllinien als Trophoblasten-Modell genutzt. In beiden Zelllinien konnte die Expression des TRPV6 Proteins nach Immunpräzipitation mittels Western-Blot und massenspektrometrischer Analyse nachgewiesen werden. Die Zellen wurden in Medium mit reduzierter Kalziumkonzentration kultiviert, um eine TRPV6-Defizienz zu simulieren. Sowohl die Zellmorphologie als auch die Proteinexpressionsprofile änderten sich in Abhängigkeit von der Kalziumkonzentration des Kulturmediums. Unter anderem führte dies bei Bewo-Zellen zu einer verminderten Expression von Zellkontakt-assoziierten Proteinen und einer erhöhten Expression der Serinprotease HTRA4. Diese ging einher mit einer erhöhten Expression von Proteinen des Ubiquitin-Proteasom-Signalweges und von Apoptose assoziierten Proteinen. Sowohl in TRPV6 defizienten Mäusen als auch in Trophoblasten einer humanen Plazenta, die in Bezug auf TRPV6 homozygote Mutationen aufweist, konnte nachgewiesen werden, dass Proteasen wie HTRA1 vermehrt exprimiert sind. Zur weiteren Untersuchung der TRPV6 Funktion wurden Bewo-Zellen heterolog mit TRPV6 Plasmiden transfiziert. Ein potenzieller Blocker von TRPV6, die Substanz BlockV6, zeigte einen hemmenden Effekt auf die Funktion von TRPV6 in Kalzium-Imaging Untersuchungen. Allerdings hatte der BlockV6 auf untransfizierte Bewo-Zellen keine Auswirkung auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration. Dies legt nahe, dass sich zum Zeitpunkt der Messung wenig oder kein TRPV6 Protein in der Plasmamembran der Bewo-Zellen befunden hat. Um zu testen, ob beide Zelllinien einerseits zur Synzytialisierung befähigt sind und andererseits die Protease HTRA4 an diesem Prozess beteiligt ist, wurde die Adenylatcyclase in beiden Chorioncarzinomzellinien durch Forskolin stimuliert. Die resultierende Erhöhung der cAMP Konzentration induziert in Bewo-Zellen Synzytialisierung, nicht jedoch in JEG3 Zellen. Die massenspektrometrischen Analysen der Proteinexpressionsprofile vor bzw. nach Inkubation mit Forskolin zeigten ebenfalls eine erhöhte Expression der Serinprotease HTRA4 sowie von Markerproteinen der Synzytialisierung (Syncytine 1 & 2, plazentare alkalische Phosphatase) in Bewo Zellen. Diese Proteine waren in JEG3 Zellen nicht nachweisbar. Zusätzlich wurde nach Forskolinstimulierung in beiden Zelllinien die vermehrte Expression des Schwangerschaftshormons hCG sowie Enzymen, die an der Steroidhormonsynthese beteiligt sind, induziert. Zusammenfassend implizieren die Ergebnisse, dass Proteasen wie HTRA4 an der Synzytialisierung beteiligt sind.
Summary Expression and analysis of TRPV6 in human trophoblast cell lines TRPV6 is a calcium-sensitive cation channel expressed in serous glands and placenta. In pregnancy, TRPV6 has an impact on placental calcium transport, as both Trpv6-deficient mice and humans possessing certain Trpv6 gene mutations exhibit skeletal bone undermineralisa tion in embryos and neonates. In both species, the feto-maternal supply of nutrients and min erals takes place via specialised cells of the placental barrier, the syncytiotrophoblasts, which express the TRPV6 protein. In this work, the chorionic carcinoma-derived Bewo and JEG3 cell lines were used as tropho blast models. In both cell lines, the expression of the TRPV6 protein could be detected after immunoprecipitation by Western blot and mass spectrometric analysis. Cells were cultured in medium with reduced calcium concentration to simulate TRPV6 deficiency. Both cell morphol ogy and protein expression profiles changed depending on the calcium concentration of the culture medium. Among other things, this led to a reduced expression of cell contact-associ ated proteins and an increased expression of the serine protease HTRA4 in Bewo cells. This was accompanied by increased expression of proteins of the ubiquitin-proteasome signalling pathway and apoptosis-associated proteins. In TRPV6-deficient mice as well as in trophoblasts of a human placenta, which has homozygous mutations of TRPV6, was it possible to prove that proteases such as HTRA1 are increasingly expressed. To further investigate TRPV6 function, Bewo cells were heterologously transfected with TRPV6 plasmids. A potential blocker of TRPV6, the substance BlockV6, showed an inhibitory effect on TRPV6 function in calcium imaging studies. However, BlockV6 on untransfected Bewo cells had no effect on intracellular calcium concentration. This suggests that little or no TRPV6 protein was present in the plasma membrane of Bewo cells at the time of measure ment. To test whether both cell lines are capable of syncytialisation on the one hand and whether the protease HTRA4 is involved in this process on the other hand, the adenylate cyclase in both chorionic carcinoma cell lines was stimulated by forskolin. The resulting in crease in cAMP concentration induced syncytialisation in Bewo cells, but not in JEG3 cells. Mass spectrometric analysis of protein expression profiles before and after incubation with forskolin also showed increased expression of the serine protease HTRA4 and marker proteins of syncytialisation (syncytins 1 & 2, placental alkaline phosphatase) in Bewo cells. These pro teins were not detectable in JEG3 cells. In addition, after forskolin stimulation, the increased expression of the pregnancy hormone hCG and enzymes involved in steroid hormone synthe sis was induced in both cell lines. In summary, the results imply that proteases such as HTRA4 are involved in syncytialisation.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-424634
hdl:20.500.11880/38310
http://dx.doi.org/10.22028/D291-42463
Erstgutachter: Wissenbach, Ulrich
Tag der mündlichen Prüfung: 24-Jul-2024
Datum des Eintrags: 29-Aug-2024
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Professur: M - Keiner Professur zugeordnet
Sammlung:SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes

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