Impact of Protein Concentration in the Follicular Fluid and Gene Expression in Mural Granulosa Cells on Oocyte Maturation, Fertilization Rate, and Embryo Quality in Intracytoplasmic Sperm Injection Cycles

Abstract

ABSTRACT Oocyte maturity, fertilization, and embryo quality are crucial to the ICSI procedure. Due to the Embryo Protection Act (EPA) in Germany and since the many published reports about follicular fluid biomarkers remain disputable, defining possible parameters that might be highly useful as non-invasive biomarkers of ICSI outcomes is crucial. Therefore, the current study objectives were to determine Amphiregulin, Luteinizing Hormone, and Insulin-Like Growth Factor II concentrations in the follicular fluid as well as to determine gene expression in the Mural Granulosa Cells (MGCs) of those (AREG, LHCGR, and IGF-II) genes and to explore their correlation to oocyte maturity, fertilization rate, and embryo development. A total of thirty-three women undergoing ICSI were recruited at the University Clinic of Saarland Fertility Centre (Homburg, Germany). Follicular fluid aspiration involved single/individual aspiration of follicles, enabling a 1:1 correlation with retrieved oocytes. Moreover, the oocytes retrieved after fertilization were followed and embryo quality was evaluated. From the thirty-three patients, a total of 108 oocytes were included in the study, and for all 108 oocytes follicular fluid and MGC samples were available. Quantitative determination of Amphiregulin and Insulin-Like Growth Factor II release in the follicular fluid was performed by ELISA according to the Human Quantikine Assay. The concentrations of Luteinizing Hormone and Follicle-Stimulating Hormone release in the follicular fluid were determined by direct immunoassay with the use of an automated analyser Cobas 8000. Total RNA extraction of individual MGCs was carried out using the Roche High Pure RNA Isolation Assay. Expression of AREG, LHCGR, IGF-II, and Actine Beta (ACTB) was analysed by StepOnePlus™ Real-Time PCR System using TaqMan Fast Advanced Master Mix. All listed components were pipetted by the Liquid Handling Robot QIAgility™. The samples were normalized concerning the reference gene Actine Beta (ACTB) using the relative quantification 2 −ΔΔCt method where the mean value of mRNA transcripts from each probe was set as one for each gene. Based on the oocyte maturity the ICSI procedure was performed with 93 oocytes. Out of the 61 fertilized oocytes, 13 zygotes were frozen, while 48 were cultivated. Thirty-four embryos (70.8%) reached good quality and fourteen (29.2%) had poor quality. The results of the current study indicate that amphiregulin concentration in follicular fluid affects oocyte maturation, fertilization rate, and embryo quality. Additionally, the concentration of amphiregulin significantly differs between patients based on Body Mass Index. The concentration of luteinizing hormone in follicular fluid affects oocyte maturation and significantly differs between fertilized and unfertilized oocyte groups as well as between good and poor embryo quality groups. The results obtained for insulin-like growth factor II indicate that the concentration of this protein in follicular fluid does not affect oocyte maturity, fertilization rate, or embryo quality. The gene expression of the studied genes (AREG, IGF-II, and LHCGR) indicates that only the expression of AREG significantly affects oocyte maturity, with AREG expression being downregulated in the immature oocyte group. LHCGR and IGF-II did not differ between groups and neither did they affect maturation, fertilization, or embryo quality. The results on infertility indicate that the concentration of Amphiregulin and Insulin-Like Growth Factor II in follicular fluid statistically differ between healthy and infertile patients. In conclusion, findings for studied proteins are of great importance to the future development of infertility treatment, especially in Germany due to its EPA. In addition, implementation of obtained results for Amphiregulin may offer prognostic information aiding the selection of the most viable oocytes and hence embryos because concentration affects oocyte maturity, fertilization rate, and embryo quality.

ZUSAMMENFASSUNG Der Reifegrad der Eizelle, die Befruchtung und die Qualität des Embryos sind entscheidend für das ICSI-Verfahren. Aufgrund des Embryonenschutzgesetzes (EPA) in Deutschland und da die vielen Publikationen über Biomarker in der Follikelflüssigkeit umstritten sind, ist das Bestimmen möglicher Parameter, die als nicht-invasive Biomarker für das ICSI-Ergebnis nützlich sein könnten, von entscheidender Bedeutung. Daher waren die Ziele der aktuellen Studie die Bestimmung der Konzentrationen von Amphiregulin, Luteinisierendem Hormon und Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II in der Follikelflüssigkeit, sowie die Bestimmung der Genexpression dieser Gene (AREG, LHCGR und IGF-II) in den muralen Granulosazellen (MGCs) und die Untersuchung einer möglichen Korrelation mit dem Reifegrad der Eizelle, der Befruchtungsrate und der Qualität der Embryonalentwicklung. Insgesamt wurden in dieser Studie dreiunddreißig Frauen, die sich am Universitätsklinikum des Saarlandes (Fertilitätszentrum) (Homburg, Deutschland) einer ICSI Behandlung unterzogen haben, rekrutiert. Bei der Entnahme der Follikelflüssigkeit wurden die einzelnen Follikel separat punktiert, so dass eine 1:1-Korrelation der punktierten Follikelflüssigkeit (einschließlich der muralen Granulosazellen) mit den gewonnenen Eizellen möglich war. Darüber hinaus wurden die nach der Befruchtung entnommenen Eizellen verfolgt und die Embryoqualität bewertet. Von den dreiunddreißig Patientinnen wurden insgesamt 108 Eizellen in die Studie aufgenommen, und für alle 108 Eizellen waren die korrespondierenden Follikelflüssigkeits- und MGC-Proben verfügbar. Die quantitative Bestimmung der Freisetzung von Amphiregulin und dem Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II in der Follikelflüssigkeit, erfolgte mittels ELISA unter Verwendung des humanen Quantikine Assays. Die Konzentrationen von Luteinisierendem Hormon und Follikelstimulierendem Hormon in der Follikelflüssigkeit wurden automatisiert durch einen direkten Immunoassay mit Hilfe eines Analysegerätes (Cobas 8000) bestimmt. Die Gesamt-RNA-Extraktion einzelner MGCs wurde mit dem Roche High Pure RNA Isolation Assay durchgeführt. Die Expression von AREG, LHCGR, IGF-II und beta Aktin (ACTB) wurde mit dem StepOnePlus™ Real-Time PCR System unter Verwendung des TaqMan Fast Advanced Master Mix analysiert. Alle aufgeführten Komponenten wurden mit dem Liquid Handling Robot QIAgility™ pipettiert. Die Proben wurden in Bezug auf das Referenzgen beta Aktin (ACTB) unter Verwendung der relativen Quantifizierung 2 −ΔΔCt -Methode normalisiert, wobei der Mittelwert der mRNA-Transkripte von jeder Sonde für jedes Gen als eins festgelegt wurde. Aufgrund des Reifegrades der Eizellen wurde das ICSI-Verfahren mit 93 Eizellen durchgeführt. Von den 61 befruchteten Eizellen wurden 13 Zygoten eingefroren, während 48 für den Embryotransfer weiter kultiviert wurden. Vierunddreißig Embryonen (70,8 %) erreichten eine gute Qualität und vierzehn (29,2 %) hatten eine schlechte Qualität. Die Ergebnisse der aktuellen Studie zeigen, dass die Amphiregulin-Konzentration in der Follikelflüssigkeit den Reifegrad der Eizelle, die Befruchtungsrate und die Qualität der Embryonen beeinflusst. Außerdem unterscheidet sich die Amphiregulinkonzentration signifikant zwischen den Patientinnen in Abhängigkeit vom Body Mass Index. Die Konzentration von Luteinisierendem Hormon in der Follikelflüssigkeit beeinflusst den Reifegrad der Eizelle und unterscheidet sich signifikant zwischen den Gruppen mit befruchteten von unbefruchteten Eizellen sowie zwischen den Gruppen mit guter und schlechter Embryoqualität. Die Ergebnisse für den Insulinähnlichen Wachstumsfaktor II zeigen, dass die Konzentration dieses Proteins in der Follikelflüssigkeit keinen Einfluss auf den Reifegrad der Eizelle, die Befruchtungsrate oder die Embryoqualität hat. Die Genexpression der untersuchten Gene (AREG, IGF-II und LHCGR) zeigt, dass nur die Expression von AREG die Eizellreife signifikant beeinflusst, wobei die AREG-Expression in der Gruppe der unreifen Eizellen herabreguliert ist. LHCGR und IGF-II unterscheiden sich nicht zwischen den Gruppen und hatten auch keinen Einfluss auf die Reifung, die Befruchtung oder die Embryoqualität. Die Ergebnisse zur Unfruchtbarkeit zeigen, dass die Konzentration von Amphiregulin und Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II in der Follikelflüssigkeit zwischen fruchtbar und unfruchtbaren Patientinnen statistisch unterschiedlich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse für die untersuchten Proteine von großer Bedeutung für die zukünftige Entwicklung der Unfruchtbarkeitsbehandlung sind, insbesondere in Deutschland aufgrund der EPA. Darüber hinaus kann die Umsetzung der für Amphiregulin erhaltenen Ergebnisse prognostische Informationen liefern, die die Auswahl der lebensfähigsten Eizellen und damit der Embryonen unterstützen, da die Konzentration den Reifegrad der Eizellen, die Befruchtungsrate und die Qualität der Embryonen beeinflusst.