Stimulation der angiogenen Aktivität mikrovaskulärer Fragmente aus Fettgewebe mit insulin-like growth factor (IGF)-1

Abstract

Das Tissue Engineering ist ein Teilgebiet der Regenerativen Medizin und befasst sich mit der Generierung von Ersatzgeweben. Hierzu werden unterschiedliche Biomaterialien, sogenannte Scaffolds, mit Zellen besiedelt. Diese Konstrukte können anschließend in den Körper implantiert werden. Dabei ist eine ausreichende Vaskularisierung der Implantate eine wichtige Voraussetzung, um ihr Überleben und ihre Funktion zu garantieren. Diese kann durch die Prävaskularisierung von Scaffolds mit mikrovaskulären Fragmenten aus Fettgewebe erzielt werden. Nach Implantation finden die Gefäßfragmente über Inoskulation Anschluss an das Gefäßsystem des Empfängers. Bis zur vollständigen Vaskularisierung der Implantate vergehen jedoch immer noch einige Tage. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit bestimmte Strategien den Vaskularisierungsprozess beschleunigen können. Die Angiogenese im Fettgewebe wird durch den insulin-like growth factor (IGF)- 1 Signalweg stimuliert. Aus diesem Grund wurde im ersten Studienabschnitt dieser Arbeit analysiert, ob durch Aktivierung dieses Signalwegs auch das Vaskularisierungspotential von Gefäßfragmenten aus Fettgewebe gesteigert werden kann. Zu diesem Zweck wurden mikrovaskuläre Fragmente aus dem Nebenhodenfett von Spendermäusen isoliert und für 24 h bei 4 °C in University-of-Wisconsin (UW)- Lösung kultiviert. Dabei war die Lösung entweder mit Vehikel, 1μM IGF-1 oder einer Kombination aus 1μM IGF-1 und 0,5 μg/ml insulin-like growth factor binding protein (IGFbp)4 supplementiert. IGFbp4 verhindert dabei über eine nicht-kompetitive Hemmung von IGF-1 die Aktivierung des IGF-1 Signalwegs. Anschließend wurde die zelluläre Zusammensetzung der Fragmente sowie ihre Viabilität, Proliferation und Expression pro-angiogener Faktoren in vitro bestimmt. Zusätzlich wurden präkultivierte Gefäßfragmente auf Kollagen-Glykosaminoglykan-Matrizes gesiedelt, welche in die Rückenhautkammern von C57BL/6 Mäusen implantiert wurden, um ihre Vaskularisierung und Inkorporation in vivo über einen 14-tägigen Beobachtungszeitraum intravitalmikroskopisch sowie histologisch und immunhistochemisch zu analysieren. Die Kultivierung der mikrovaskulären Fragmente mit IGF-1 führte zu einer Verbesserung ihrer Viabilität und einer vermehrten Expression pro-angiogener Faktoren, ohne ihre zelluläre Zusammensetzung und Proliferation zu beeinflussen. Dementsprechend zeigten Scaffolds, die mit IGF-1-stimulierten mikrovaskulären Fragmenten besiedelt wurden, eine verbesserte in vivo Vaskularisierung im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen. Diese pro-angiogene Wirkung in vivo wurde durch die zusätzliche Exposition der mikrovaskulären Fragmente gegenüber IGFbp4 aufgehoben. Dies zeigt, dass eine Stimulation mit IGF-1 eine vielversprechende Strategie darstellt, um das Vaskularisierungspotential mikrovaskulärer Fragmente zu steigern. Im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob das hohe Vaskularisierungspotential von IGF-1-stimulierten Gefäßfragmenten nach Kryokonservierung erhalten bleibt und somit auch nach einer Langzeitlagerung der Fragmente genutzt werden kann. Hierfür wurden mikrovaskuläre Fragmente erneut für 24 h bei 4 °C in UW-Lösung kultiviert, die mit IGF-1 supplementiert war. Anschließend wurden die Gefäßfragmente entweder direkt (Kontrolle) oder nach einer 7-tägigen Kryokonservierung bei -196 °C auf Scaffolds transferiert, welche in die Rückenhautkammern von C57BL/6 Mäusen implantiert wurden. Die Vaskularisierung der Implantate wurde in vivo mit Hilfe der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie sowie histologischen und immunhistochemischen Techniken über einen 14-tägigen Beobachtungszeitraum untersucht. Die Kryokonservierung der präkultivierten Gefäße führte zu einer langsameren Vaskularisierung der implantierten Scaffolds und zu einem verzögerten Reifungsprozess der einzelnen Blutgefäße. Dementsprechend wurde am Ende des 14-tägigen Beobachtungszeitraums ein geringerer Anteil an Gefäßen innerhalb sowie im umgebenden Rückenhautkammergewebe der Scaffolds nachgewiesen, die mit kryokonservierten mikrovaskulären Fragmenten besiedelt worden waren. Daraus kann geschlossen werden, dass das Vaskularisierungspotential von IGF-1-stimulierten mikrovaskulären Fragmenten durch eine Kryokonservierung stark beeinträchtigt wird. Eine vergleichbare Vaskularisierung der Scaffolds, wie durch IGF1-stimulierte, nicht-kryokonservierte Gefäßfragmente, kann nicht erreicht werden.

Tissue Engineering is a part of regenerative medicine focusing on the generation of tissue substitutes. For this purpose different biomaterials, referred to as scaffolds, are seeded with cells. Subsequently, these constructs can be implanted into the body. A sufficient vascularization of the implants is a crucial determinant for their survival and the maintenance of their function. This can be achieved by the prevascularization of scaffolds with microvascular fragments from adipose tissue. After implantation microvascular fragments develop interconnections to the host vasculature by inosculation. However, the implants still require several days for complete vascularization. Hence, in the present thesis strategies were examined that may accelerate the process of vascularization. Angiogenesis of adipose tissue is stimulated by the insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling pathway. Accordingly, in the first part of the present thesis it was analyzed whether the activation of this pathway leads to an increased vascularization potential of adipose tissue-derived microvascular fragments. For this purpose, microvascular fragments were isolated from the epididymal fat pads of donor mice and cultivated for 24 h in 4 °C University-of-Wisconsin (UW)-solution. The solution was either supplemented with vehicle, 1μM IGF-1 or a combination of 1μM IGF-1 and 0.5 μg/ml insulin-like growth factor binding protein (IGFbp)4. Thereby IGFbp4 inhibits the IGF-1 signaling pathway by a non-competitive inhibition of IGF-1. Thereafter, the cellular composition of the microvascular fragments as well as their viability, proliferation and growth factor expression were determined in vitro. Additionally, pre- cultivated microvascular fragments were seeded onto collagen-glycosaminoglycan matrices, which were implanted into the dorsal skinfold chambers of C57BL/6 mice to analyze in vivo their vascularization and incorporation over a 14-days observation period by means of intravital fluorescence microscopy as well as histology and immunohistochemistry. The cultivation of microvascular fragments with IGF-1 improved their viability and upregulated their expression of pro-angiogenic factors without affecting their cellular composition and proliferation. Accordingly, scaffolds seeded with IGF-1- stimulated microvascular fragments exhibited an enhanced in vivo vascularization when compared to vehicle-treated controls. This pro-angiogenic effect in vivo was reversed by additional exposure of the microvascular fragments to IGFbp4. These findings indicate that IGF-1-stimulation represents a promising strategy to improve the vascularization capacity of microvascular fragments. In the second part of the present thesis it was analyzed whether the high vascularization capacity of IGF-1-stimulated microvascular fragments can be maintained during cryopreservation and, therefore, may be even beneficial after long- term storage of microvascular fragments. For this purpose, microvascular fragments were cultivated again for 24 h in 4 °C UW solution supplemented with IGF-1. Subsequently, the microvascular fragments were either directly transferred (control) or after being cryopreserved at -196 °C for 7 days onto scaffolds, which were implanted into the dorsal skinfold chambers of C57BL/6 mice. The vascularization of the implants was assessed by means of intravital fluorescence microscopy, histology and immunohistochemistry over a 14-days observation period. The cryopreservation of pre-cultivated microvascular fragments resulted in an impaired vascularization of implanted scaffolds and a delayed maturation process of individual blood vessels. Correspondingly, after the 14-days observation period, a lower number of vessels was detected within as well as in the surrounding tissue of scaffolds seeded with cryopreserved microvascular fragments. Therefore, it can be concluded that the additional cryopreservation has a severe impact on the vascularization capacity of microvascular fragments stimulated with IGF-1. A comparable vascularization of scaffolds, such as caused by IGF-1-stimulated non- cryopreserved microvascular fragments, cannot be achieved.