Anti-inflammatorische und pro-angiogene Strategien zur Verbesserung der Revaskularisierung und endokrinen Funktion transplantierter Langerhans-Inseln

Abstract

1. Zusammenfassung Die Inseltransplantation stellt eine vielversprechende Strategie zur täglichen Insulinsubstitution bei Diabetes mellitus Typ 1 (T1D)-Patienten dar. Allerdings werden bis dato drei bis vier Spenderorgane benötigt, um einen T1D-Patienten erfolgreich zu transplantieren. Eine wesentliche Ursache hierfür ist, dass die Blutgefäße des Empfängergewebes nicht schnell genug in die transplantierten Langerhans-Inseln einwachsen. Diese unzureichende Revaskularisierung führt zu einer Minderversorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff, wodurch ein Großteil der Langerhans-Inseln direkt nach der Transplantation abstirbt. Dementsprechend sind therapeutische Strategien, welche die Revaskularisierung von transplantierten Langerhans-Inseln verbessern, von großem klinischen Interesse.

1. Studienabschnitt: Das nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor protein (NLRP)3-Inflammasom ist ein zytoplasmatischer Multiproteinkomplex, der nicht nur in Immunzellen, sondern auch in β-Zellen der Langerhans-Inseln vorkommt. Allerdings ist bis heute nur wenig über die Funktion von NLRP3 in Langerhans-Inseln bekannt. Im ersten Studienabschnitt dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob die Aktivität von NLRP3 die Revaskularisierung und endokrine Funktion transplantierter Langerhans-Inseln beeinflusst. Hierfür wurden isolierte Wildtyp (WT) Langerhans-Inseln, die mit Vehikel (WT + Vehikel) oder dem NLRP3-Inhibitor CY-09 (WT + CY-09) behandelt wurden, mithilfe von immunhistochemischen und durchflusszytometrischen Analysen auf ihre zelluläre Zusammensetzung sowie Viabilität untersucht. Des Weiteren wurde die endokrine Funktion der isolierten WT, NLRP3-knockout (Nlrp3-/-), WT + Vehikel und WT + CY-09 Langerhans-Inseln mittels eines enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen, quantitative real-time polymerase chain reactions (qRT-PCR) und verschiedenen Angiogenese-Assays wurde der zugrundeliegende regulatorische Mechanismus der erhöhten Insulin-Sekretion und der verbesserten Revaskularisierung nach Verlust oder Inhibition von NLRP3 entschlüsselt. In vivo wurden WT + Vehikel und WT + CY 09 Langerhans-Inseln auf die quergestreifte Hautmuskulatur der Rückenhautkammerpräparation von WT Empfängermäusen transplantiert, um die Revaskularisierung der Transplantate unter Verwendung der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren. Abschließend wurden WT, Nlrp3-/-, WT + Vehikel und WT + CY-09 Langerhans-Inseln unter die Nierenkapsel von diabetischen WT Empfängertieren transplantiert, um die Wiederherstellung physiologischer Blutglukosespiegel untersuchen zu können. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivität von NLRP3 keinen Einfluss auf die Viabilität und zelluläre Zusammensetzung isolierter Langerhans-Inseln hat. Hingegen beeinflusst das Inflammasom die endokrine Funktion der Langerhans-Inseln, denn nach Verlust oder Inhibition von NLRP3 konnte eine deutlich erhöhte Insulin-Sekretion festgestellt werden. Detaillierte Analysen zeigten, dass diese durch eine gesteigerte Aktivität der Transkriptionsfaktoren pancreatic and duodenal homeobox-1 (PDX-1) und v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A (MafA) vermittelt wird. In vivo konnte nicht nur eine verbesserte Insulin-abhängige Revaskularisierung transplantierter Langerhans-Inseln nach Inhibition von NLRP3 festgestellt werden, sondern auch eine beschleunigte Wiederherstellung einer Normoglykämie nach Transplantation der Nlrp3-/- und WT + CY-09 Langerhans-Inseln in diabetische Mäuse. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die pharmakologische Inhibition von NLRP3 eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Verbesserung der Inseltransplantation darstellt.

2. Studienabschnitt: Mikrovaskuläre Fragmente (MVF) sind kleine Blutgefäßsegmente, welche in zahlreichen experimentellen Studien der letzten Jahre erfolgreich als Prävaskularisierungseinheiten eingesetzt wurden. In diesem Zusammenhang konnte kürzlich in einer proof-of-concept Studie gezeigt werden, dass MVF auch den Erfolg der Inseltransplantation steigern. Hierbei wurden MVF und dissoziierte Inselzellen zu sogenannten prävaskularisierten Pseudoinseln fusioniert und anschließend in diabetische Mäuse transplantiert. Die Verlaufsanalyse zeigte eindrücklich eine beschleunigte Wiederherstellung physiologischer Blutglukosespiegel. Allerdings ist die Generierung dieser Pseudoinseln ein zeitaufwendiger und komplikationsanfälliger Prozess, welcher sich nicht in den klinischen Alltag integrieren lässt. Daher sollte im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit eine vereinfachte Strategie entwickelt werden, welche es erlaubt, MVF zur Verbesserung der Inseltransplantation einzusetzen. Zu Beginn wurde die zelluläre Zusammensetzung sowie Viabilität isolierter Langerhans-Inseln und MVF immunhistochemisch untersucht. Anschließend wurden definierte Anzahlen von MVF und Langerhans-Inseln unter die Nierenkapsel oder in das subkutane Gewebe diabetischer Empfängermäuse ko-transplantiert. Als Kontrolle wurde die identische Zahl an Langerhans-Inseln oder MVF alleine transplantiert. Die endokrine Funktion der Transplantate wurde anhand der Messung der Blutglukosespiegel analysiert. Am Ende des Beobachtungszeitraums wurde den Empfängertieren das Gewebe mit den Transplantaten für immunhistochemische Färbungen und zur Bestimmung des Insulingehalts entnommen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ko-Transplantation von 250 Langerhans-Inseln und 20000 MVF unter die Nierenkapsel diabetischer Empfängermäuse innerhalb von 14 Tagen zu einer Normoglykämie führt. Hingegen führte die alleinige Transplantation der identischen Anzahl an Langerhans-Inseln oder MVF über den gesamten Beobachtungszeitraum nicht zu physiologischen Blutglukosespiegeln. Die Ko-Transplantation von 500 oder 1000 Langerhans-Inseln mit 40000 MVF in das subkutane Gewebe von diabetischen Empfängertieren stellte ebenfalls wieder eine Normoglykämie her. Auch hier zeigte sich, dass Empfängertiere, die lediglich mit Langerhans-Inseln alleine transplantiert wurden, hyperglykäm blieben. Zusammenfassend stellt die im zweiten Studienabschnitt entwickelte Ko-Transplantation von MVF und Langerhans-Inseln nicht nur eine sehr effiziente, sondern auch eine leicht durchzuführende Strategie dar, die zukünftig die klinische Inseltransplantation verbessern könnte.

2. Summary Anti-inflammatory and pro-angiogenic strategies to improve revascularization and endocrine function of transplanted islets Pancreatic islet transplantation represents a promising therapeutic strategy to improve glycometabolic control in patients with type 1 diabetes mellitus. However, currently this approach requires 3-4 donor organs for successful treatment of one patient. A major reason for this is the fact that the blood vessels of the recipient tissue do not grow fast enough into the transplanted avascular islets. This inadequate revascularization leads to an insufficient supply with nutrients and oxygen, resulting in the regression of many islets immediately after transplantation. Accordingly, therapeutic strategies that improve the revascularization of transplanted islets are of major clinical interest.

1. Study section: The nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor protein (NLRP)3 inflammasome is a cytoplasmic multiprotein complex that is found not only in immune cells but also in β-cells of islets. However, the effect of NLRP3 on islet transplantation is still unknown. Therefore, the aim of the first study section of this thesis was to clarify whether loss or inhibition of NLRP3 influences the revascularization and endocrine function of transplanted islets. For this purpose, the cellular composition and viability of isolated wild-type (WT) islets exposed to vehicle (WT + Vehicle) or the NLRP3 inhibitor CY-09 (WT + CY-09) were analyzed by means of immunohistochemistry and flow cytometry. Furthermore, the endocrine function of isolated WT, NLRP3-knockout (Nlrp3-/-), WT + Vehicle and WT + CY-09 islets was investigated by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The underlying regulatory mechanism of the increased insulin secretion and enhanced revascularization after loss or inhibition of NLRP3 was unraveled by means of Western blotting, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and different angiogenesis assays. In vivo, WT + Vehicle and WT + CY-09 islets were transplanted onto the striated muscle tissue of WT dorsal skinfold chamber-equipped mice. The revascularization of the grafts was analyzed by intravital fluorescence microscopy. Finally, WT, Nlrp3-/-, WT + Vehicle and WT + CY-09 islets were transplanted under the kidney capsule of diabetic WT mice to study the restoration of normoglycemia. The results showed that the activity of NLRP3 does not affect the viability and cellular composition of isolated islets. In contrast, the inflammasome affects the endocrine function of isolated islets, as indicated by a significantly improved insulin secretion after loss or inhibition of NLRP3. Detailed analyses revealed that this was caused by an increased activity of the transcription factors pancreatic and duodenal homeobox-1 (PDX-1) and v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A (MafA). In vivo, not only an improved insulin-induced revascularization of transplanted WT + CY-09 islets was detected, but also an accelerated restoration of physiological blood glucose levels in diabetic animals transplanted with Nlrp3-/- and WT + CY-09 islets. In conclusion, these results demonstrate that the pharmacological inhibition of NLRP3 represents a promising therapeutic strategy to improve the outcome of islet transplantation.

2. Study section: Microvascular fragments (MVF) are small blood vessel segments that have been successfully used as vascularization units in numerous experimental studies. Recently, a proof-of-concept study demonstrated that MVF also improve the success of islet transplantation. In this study, MVF and dissociated islet cells were fused into prevascularized pseudoislets, which were subsequently transplanted under the kidney capsule of diabetic mice. The obtained data showed an accelerated restoration of physiological blood glucose levels after transplantation of the prevascularized pseudoislets. However, the generation of these pseudoislets is a time-consuming and complicate process, which cannot be easily implemented into clinical practice. Therefore, the aim of the second study section of the present thesis was to develop a simplified strategy that allows the use of MVF to improve islet transplantation. First, the cellular composition and viability of isolated islets and MVF were assessed by immunohistochemistry. Subsequently, defined numbers of MVF and islets were co-transplanted under the kidney capsule or into the subcutaneous tissue of diabetic mice. As a control, identical numbers of islets or MVF alone were transplanted. The endocrine function of the grafts was analyzed by measuring blood glucose levels. At the end of the observation period, the tissue with the grafts was explanted for immunohistochemical stainings and the determination of insulin content. The results showed that co-transplantation of 250 islets and 20000 MVF under the kidney capsule of diabetic animals results in normoglycemia within 14 days. In contrast, transplantation of the identical number of islets or MVF alone did not restore physiological blood glucose levels throughout the observation period. The co-transplantation of 500 or 1000 islets with 40000 MVF into the subcutaneous tissue of diabetic animals also resulted in normoglycemia, whereas animals transplanted with islets alone remained hyperglycemic. In summary, the herein introduced co-transplantation of MVF and islets represents not only a very efficient but also an easy-to-perform strategy that may markedly improve the outcome of clinical islet transplantation in the future.