Das Membranpotential von Erythrozyten : Methodische Entwicklungen und Untersuchung von Patientenproben

Abstract

Begonnen habe ich mit der Aufgabenstellung, die MBE- Methode an der Universität des Saarlandes zu etablieren. MBE steht dabei für Macey, Bennekou und Egée, welche diese Methode entwickelt und weiterentwickelt haben. Dabei handelt es sich um eine Messung des Potentials des Wasserstoffs (pH, lateinisch pondus hydrogenii) einer Suspension aus einer Ringerlösung und gepackten Erythrozyten, welchen verschiedene Substanzen zugefügt werden können, um das Öffnungs- und das Schließverhalten verschiedener Ionenkanäle zu beeinflussen. Wichtig ist, dass es sich bei der Ringerlösung um eine ungepufferte Lösung handelt und dass der Protonophor Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) hinzugefügt wird. Durch CCCP haben die Protonen die Möglichkeit, sich frei über die Membran zu bewegen, sodass sich die H+- Verteilung entsprechend des Membranpotentials einstellt. Über eine Formel, welche ich im weiteren Verlauf dieser Arbeit erkläre, können die pH-Wert Veränderungen in das Membranpotential der Erytrhrozyten umgerechnet werden und somit Membranpotentialveränderungen gemessen werden, welche sich durch Manipulation der Erythrozyten ergeben. Dies ist möglich, da der pH-Wert im Zellinneren der Erythrozyten aufgrund der Pufferkapazität des Hämoglobins stabil bei ungefähr pH 7,0 liegt und somit die Änderungen des extrazellulären pH-Wertes streng proportional zum Membranpotential verlaufen. Im Rahmen der Etablierung habe ich unter anderem anhand von Experimenten untersucht, welche Hämatokritanteile am geeignetsten für die verschiedenen Experimentprotokolle sind und in welcher Konzentration die verschiedenen Ionenkanalmanipulatoren ihre stärkste Wirkung zeigen. Inzwischen wird die MBE-Methode in der Arbeitsgruppe auch von weiteren Wissenschaftlern für Forschungszwecke genutzt und stellt eine Methode dar, welche reproduzierbare und somit gut vergleichbare Ergebnisse erzielt. Nach der Etablierung der MBE-Methode habe ich versucht die Membranpotenzialveränderungen über pH-Wert abhängige Farbstoffe am Konfokalmikroskop optisch darzustellen und dazu verschiedene Ansätze getestet und untersucht, welche allerdings alle ohne Erfolg blieben. Weiterhin habe ich mithilfe der MBE-Methode verschiedene Patientenproben untersucht. Die Patienten, deren Blutproben ich für diese Arbeit verwenden durfte, haben verschiedene Mutationen in Ionenkanälen ihrer Erythrozyten oder andere Erkrankungen ihrer Erythrozyten. Ich konnte für die jeweiligen Erythrozytenanomalien typische Membranpotentialverläufe charakterisieren und beispielsweise feststellen, dass Patienten mit Chorea-Akanthozytose (ChAc) auf den Gárdos-Kanal Aktivator 3-Oxime-6,7-dichloro-1H-indole-2,3-dione (NS309) mit einer deutlich stärkeren Hyperpolarisation des Membranpotentials reagieren als gesunde Kontrollen. Dies kann damit erklärt werden, dass die Erythrozyten der Patienten mit Chorea-Akanthozytose eine geringere Lebensdauer haben. Beim Alterungsprozess von Erythrozyten nimmt die Funktionsfähigkeit der Gárdos-Kanäle ab. Somit reagieren die Erythrozyten der ChAc- Patienten, deren Erythrozyten jünger sind und damit eine höhere Anzahl von Gárdos- Kanälen aufweisen, stärker auf die Aktivierung des Gárdos-Kanals.

I started with the task of establishing the MBE method at Saarland University. MBE is the short form of Macey, Bennekou and Egée, who developed and refined this method. It is a pH measurement of a suspension consisting of a Ringer's solution and packed erythrocytes, to which various substances can be added to influence the opening and closing behaviour of various ion channels. It is important that the Ringer's solution is an unbuffered solution and that the protonophore carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) is added. CCCP allows the protons to move freely across the membrane, so that the H+ distribution is adjusted according to the membrane potential. Using a formula, which I will explain later in this paper, the pH changes can be converted into the membrane potential of the erythrocytes. Thus membrane potential changes, which are resulting from manipulation of the erythrocytes can be measured. This is possible because the pH value inside the erythrocytes is stable at about pH 7.0 due to the buffering capacity of haemoglobin and thus the changes in the extracellular pH value are strictly proportional to the membrane potential. Within the framework of the establishment, I have investigated, among other things, by means of experiments, which haematocrit is most suitable for the different experimental protocols and at which concentration the different ion channel manipulators show their strongest effect. In the meantime, the MBE method is also used by other scientists of the work-group for research purposes and represents a method that achieves reproducible and thus easily comparable results. After establishing the MBE method, I tried to visualise the membrane potential changes using pH-dependent dyes on the confocal microscope and tested and investigated various approaches for this purpose, which were all unsuccessful. Furthermore, I examined various patient samples using the MBE method. The patients whose blood samples I could use for this work have various mutations in ion channels of their erythrocytes or other diseases of their erythrocytes. I was able to characterize typical membrane potential courses for the respective erythrocyte anomalies and determine, for example, that patients with chorea-acanthocytosis (ChAc) react to the Gárdos channel activator 3-oxime-6,7-dichloro-1H-indole-2,3-dione (NS309) with a significantly stronger hyperpolarisation of the membrane potential than healthy controls. This can be explained by the fact that the erythrocytes of patients with chorea acanthocytosis have a shorter lifespan. During the ageing process of erythrocytes, the functionality of the Gárdos channels decreases. Thus, the erythrocytes of ChAc patients, whose erythrocytes are younger and have a higher number of active Gárdos channels, react more strongly to the activation of the Gárdos channel.