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doi:10.22028/D291-42101
Title: | Anwendung der MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Diagnostik des Bandwurms Taenia saginata unter Berücksichtigung verschiedener Probenlagerungsbedingungen |
Author(s): | Wendel, Tabea Pauline |
Language: | German |
Year of Publication: | 2023 |
Place of publication: | Homburg/Saar |
DDC notations: | 610 Medicine and health |
Publikation type: | Dissertation |
Abstract: | Einleitung: Humane Infektionen mit dem Schweinebandwurm Taenia saginata können eine
intestinale Taeniasis auslösen, die von asymptomatischer Trägerschaft bis zu schwerwiegenden
gastrointestinalen Symptomen führen kann. Die Infektion mit T. saginata ist vor allem in
Ländern des globalen Südens mit schlechten sanitären Verhältnissen von Bedeutung. Die
Diagnostik erfolgt primär über den Nachweis von Taenia-Eiern in Stuhlproben. Problematisch
bei der Taeniasis ist die speziesspezifische Diagnostik, insbesondere die Differenzierung
zwischen den morphologisch identischen Eiern der beiden Arten T. saginata und
Taenia solium, da die durch den Rinderbandwurm T. solium ausgelöste Erkrankung
Zystizerkose lebensbedrohlich sein kann und spezifisch therapiert werden muss. In dieser
Arbeit wurde die mögliche Identifizierung von T. saginata aus humanen Stuhlproben mittels
matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie
(MS) untersucht. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem mittels Laserbeschuss
Proteine aus einer zu untersuchenden Probe gelöst werden, um anschließend anhand ihrer
Größe und Fluggeschwindigkeit aufgetrennt und mittels eines Organismus-spezifischen
Proteinspektrumprofils identifiziert zu werden. Diese Technik wird im mikrobiologischen
Labor standardmäßig zur Identifikation von Bakterien und Pilzen angewendet, hat jedoch
bisher kaum Anwendung zur Diagnostik von Parasiten gefunden
Material und Methoden: Die Versuchsreihe wurde an acht in 0,45% Natriumchlorid
gelagerten Proben durchgeführt, wobei es sich bei sechs Proben um T. saginata Proglottiden
und bei zwei Proben um T. saginata Eier handelte. Es wurde ein in domo etabliertes Protokoll
genutzt, die T. saginata Proben wurden umfangreich massenspektrometrisch analysiert und
einer bestehenden in-house-database zur massenspektrometrischen Identifikation
pathogenspezifischer Proteinspektren hinzugefügt. Es wurde eine externe Validierung
durchgeführt, bei welcher die jeweils übrigen Proteinspektren der T. saginata Proben mit der
in-house-database verglichen wurden. Die Genauigkeit der MALDI-TOF MS-basierten
Identifizierung wurde mittels eines log score values (LSV) angegeben, der die Ähnlichkeit der
Proteinspektren quantifiziert. Ein LSV zwischen 2,29-2,0 zeigt eine sichere Identifikation auf
Speziesebene an, LSVs zwischen 1,7-1,9 hingegen zeigen eine sichere Identifikation auf
Gattungsebene an. Ein LSV <1,7 spricht für eine unzureichend genaue Identifikation. Die Spezieszugehörigkeit aller Proben wurde molekulargenetisch mittels Sequenzierung des
cox-1 Gens überprüft und phylogenetisch untersucht. Weiterführend wurde der Einfluss
verschiedener Probenlagerungsmedien über einen Zeitraum von 24 Wochen auf die
massenspektrometrische Identifikationsrate untersucht.
Ergebnisse: Alle acht Proben der Versuchsreihe wurden mittels Sequenzierung als T. saginata
identifiziert, es wurde auch eine phylogenetische Clusterung beobachtet. Nach Einfügen aller
Proben in die konzipierte in-house-database konnten insgesamt sechs der acht untersuchten
T. saginata Proben (75%) mindestens auf Gattungsebene verlässlich identifiziert und so von
anderen Organismen differenziert werden. In drei Fällen konnte dabei auch eine
speziesspezifische Identifikation erreicht werden. Zwei Proben wiesen jedoch keine
Ähnlichkeiten mit der Referenzdatenbank.
Die Identifikation von T. saginata konnte in den Probenlagerungsmedien 0,45%
Natriumchlorid, 70% Ethanol sowie in Wasser von LC-MS Qualität gleichermaßen valide auch
über einen Lagerungszeitraum von 24 Wochen durchgeführt werden. Lediglich für das
Lagerungsmedium Formalin (37%) konnten keinerlei Proteinspektren generiert werden.
Diskussion: Mittels MALDI-TOF MS kann eine Identifizierung von T. saginata auf
Gattungsebene durchgeführt werden, jedoch bedarf die Methodik noch weiterer Optimierung
hinsichtlich einer Standardisierung der Arbeitsprotokolle und Lagerungsbedingungen sowie
weiterführender Untersuchungen mit einem vergrößerten Probenpool inklusive weiterer Taenia
Arten unterschiedlichen geographischen Ursprungs, insbesondere T. solium. Ein weiterer Fokus
sollte auf die Erweiterung der Referenzdatenbank gelegt werden, deren Qualität einen
maßgeblichen Einfluss auf die massenspektrometrische Identifikationsgenauigkeit zeigt. Als
Lagerungsmedien können 0,45% Natriumchlorid, 70% Ethanol sowie Wasser in LC-MSQualität
gleichermaßen erfolgreich genutzt werden. Introduction: Human infections with the tapeworm Taenia saginata can cause intestinal taeniasis, ranging from asymptomatic carriage to rare severe gastrointestinal symptoms. Taeniasis is mainly important in developing countries with poor sanitation standards but is increasingly becoming more significant to the Western world due to increasing globalization and migration. Diagnosis is primarily based on the detection of Taenia eggs in stool samples. Problematic with taeniasis is the species-specific diagnosis, especially the differentiation between the morphologically identical eggs of the two species T. saginata and Taenia solium, since cysticercosis caused by T. solium can be potentially life-threatening and accordingly requires increased attention including contact screening. In this work, we investigated the potential identification of T. saginata from human stool samples using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This technique uses laser bombardment to dislodge proteins, which are separated based on their size and flight speed, allowing them to be identified using an organism-specific protein spectrum profile. The technique is standardly used in diagnostic laboratories for the identification of bacteria and fungi but has little application to the diagnosis of parasites. Material and Methods: Six samples of T. saginata proglottids and two samples of T. saginata eggs, stored in sodium chloride 0,45%, were provided from our laboratory and from international partner laboratories. A before established protocol was used for sample processing. The T. saginata samples were analyzed by mass spectrometry and added to the existing in-house-database. An external validation was performed, in which the remaining protein spectra of the T. saginata samples were compared with the in-house-database. The accuracy of MALDI-TOF MS-based identification is indicated by a log score value (LSV), which quantifies the similarity of protein spectra. An LSV between 2.29-2.0 indicates confident identification at the species level, LSVs between 1.7-1.9 indicate confident identification at the genus level, and an LSV <1.7 indicates no confident identification. All samples were validated molecularly by sequencing of the cox-1 gene and further statistically analyzed looking for similarity in protein spectrum profiles and phylogenetic similarity of sequencing results. Further, the influence of different sample storage media over a period of 24 weeks on mass spectrometric identification was investigated. Results: All eight samples of the experimental series were correctly identified as T. saginata by sequencing, a phylogenetic clustering was also observed. After inserting all samples into the designed in-house database, six of the eight T. saginata samples could be reliably identified at least at the genus level and thus differentiated from other organisms. This corresponds to a percentage of 75%. In three cases, a species-specific identification could also be achieved. However, two samples did not show similarities with the reference database. No differences for the validation of T. saginata were detectable when the samples were stored in sodium chloride 0,45%, ethanol 70% or water with LC-MS quality for 24 weeks. For the storage media formalin 37% no protein spectra could be identified. Discussion: The use of MALDI-TOF MS as an identification tool for T. saginata was successful but the methodology needs further optimization regarding standardization of the working protocols and storage conditions as well as further investigations with an enlarged sample set with larger geographic variety and different species such as T. solium. Another focus should be the extension of the reference database, whose size shows a significant influence on mass spectrometric identification quality. Sodium chloride 0.45%, ethanol 70% as well as water in LC-MS quality can be used equally for subsequent MALDI-TOF MS analysis. |
Link to this record: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-421014 hdl:20.500.11880/37858 http://dx.doi.org/10.22028/D291-42101 |
Advisor: | Becker, Sören |
Date of oral examination: | 27-May-2024 |
Date of registration: | 12-Jun-2024 |
Faculty: | M - Medizinische Fakultät |
Department: | M - Infektionsmedizin |
Professorship: | M - Prof. Dr. Sören Becker |
Collections: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
Files for this record:
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Veröffentlichung Dissertation Tabea P. Wendel 2024.pdf | Dissertationsprojekt zur massenspektrometrischen Analyse des Bandwurms Taenia saginata unter Berücksichtigung verschiedener Probenlagerungsbedingungen. | 11,2 MB | Adobe PDF | View/Open |
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