Microfluidic platform to study the transport properties of model cell membranes

Abstract

Freestanding lipid bilayers are a possibility to mimic biological cell membranes. Forming those free standing bilayer in a microfluidic chip, two aqueous fingers surrounded by an oily lipid containing phase are brought in contact. At the point where the two lipid decorated fingers touch, a bilayer is eventually formed. My study introduces a pressure-controlled method to manipulate the aqueous fingers, which extends the lifespan of the formed lipid bilayer from minutes to hours. Varying pressures differences across the chip's aqueous fingers further allows for bending the bilayer to a desired curvature that allows to extract monolayer and bilayer tension in as single experiment as well as measuring the electrical properties of the lipid bilayer. The great stability and long lifetime of the lipid bilayer further enabled exploring proteins incorporated into lipid bilayers. In the current thesis, the microfluidic scheme was used to create a GFP-labelled variant of Arch-3 for tracking its synthesis and incorporation into the bilayer under blue light excitation. Electrophysiological characteristics of Arch-3 were explored using a green laser, revealing distinct current steps indicative of pore dynamics. Thus, this approach facilitates the study of modified transmembrane protein constructs, generated from cell-free extracts by DNA modification, which is a foundational step in exploring signalling cascades with coupled receptor proteins. In ongoing work, I apply this technique to study phototransduction in porcine retinas incorporated into lipid bilayers. Preliminary results suggest increased transducin current intensity in dark conditions, followed by a decrease upon light exposure. And confirm the great possibility of this method to explore complex processes in and across bilayer.

Freistehende Lipid-Doppelschichten ermöglichen es biologische Zellmembranen zu imitieren. Um diese freistehenden Lipid-Doppelschichten in einem Mikrofluidik-Chip herzustellen, werden zwei wässrige Fingern, umgeben von einer öligen lipidgefüllten Phase, in Kontakt gebracht. Die Lipid-Doppelschicht bildet sich an der Berührstelle der lipiddekorierten wässrigen Finger. Im Ramen meiner Untersuchungen wird eine druckkontrollierte Methode zur Manipulation der wässrigen Finger vorgestellt, die es ermöglicht die Lebensdauer der gebildeten Doppelschicht von ursprünglich wenigen Minuten auf Stunden zu verlängern. Durch variierende Druckunterschiede zwischen den wässrigen Fingern lässt sich der Doppelschicht eine gewünschte Krümmung aufprägen. Außerdem kann damit die Oberflächenspannung einer lipiddekorierten Öl-Wasser Grenzfläche, sowie die Membranspannung und die elektrischen Eigenschaften der Doppelschicht in einem einzelnen Experiment bestimmt werden. Die beachtliche Stabilität und Lebensdauer der Lipid-Doppelschicht ermöglicht es darüber hinaus Proteine in diese Doppelschichten einzubinden. In der vorliegenden Arbeit wurde die druckkontrollierte Stabilisierung verwendet, um die Synthese einer GFP markierten Variante von Arch-3 und ihre Integration in eine Doppelschicht unter blauer Lichtanregung zu verfolgen. Elektrophysiologische Eigenschaften von Arch-3 wurden unter grüner Laserbeleuchtung untersucht, wobei eine stufenweise Zunahme des Ionenstroms beobachtet wurde, was auf eine entsprechende Porendynamik hindeuten. Damit ermöglicht diese Methode die Untersuchung modifizierter transmembraner Proteinstrukturen, die aus zellfreien Extrakten durch DNA-Modifikation erzeugt werden, was einen fundamentalen Schritt zur Untersuchung von Signal-Kaskaden mit gekoppelten Rezeptorproteinen darstellt. In einem laufenden Projekt wende ich diese Technik an, um die Fototransduktion von in Lipid-Doppelschichten eingebetteter Schweineretina zu untersuchen. Vorläufige Ergebnisse deuten auf eine erhöhte Transducin-Stromintensität in Dunkelheit hin, gefolgt von einem Abfall bei Lichteinwirkung.