Validierung von potenziell durch PAX6 regulierten Transkripten mithilfe eines siRNA basierten Aniridie-Zellmodells

Abstract

Zusammenfassung Ziel: Es konnte in Vorarbeiten [39,40] gezeigt werden, dass verschiedenste Gene bei Aniridie-Patienten sowohl in den Bindehaut- als auch in den Limbusepithelzellen vermindert exprimiert werden. Eine Regulierung der Transkripte dieser Gene durch PAX6 wird vermutet. In dieser Arbeit wurde überprüft, ob sich die Transkripte der Gene in einem Aniridie-Zellmodell auf Basis eines reinen PAX6-mRNA-Knockdowns in gleicher Weise verändern wie bei den Aniridieerkrankten Patienten. Ziel war es herauszufinden, ob die beobachtete mRNA-Expression dieser Gene durch PAX6 reguliert wird oder ob ihre Expression anderen externen Faktoren unterliegt. Methoden: Durch die Entnahme von gesunden Limbusepithelzellen von Spender-Hornhäuten und die Behandlung dieser durch siRNA gegen PAX6, wurden die Bedingungen der PAX6-assoziierte Aniridie nachgeahmt. Zusätzlich wurde ein Teil der Kulturen mit Ca2+ behandelt, um die Ergebnisse bei verschiedenen Differenzierungsgraden zu vergleichen. Mittels SYBR-green qPCR wurde geprüft, inwieweit die mRNA-Expression der Gene TGFBI, TMEM47, CRYAB, NTNG1, EGFL6, PAPLN, ABI3BP, SLITRK4, CCK, LRRN1, ATF3, MITF, PXDN in den Zellmodellen, in Abhängigkeit zu PAX6, betroffen werden. Die relative Protein-Expression von PAX6 nach Behandlung mit siRNA wurde mithilfe eines Western Blots untersucht. Ergebnisse: Die mRNA-Expression von TGFBI und TMEM47, sowie CRYAB wiesen eine höchst signifikante Herunterregulierung nach siRNA Behandlung gegen PAX6 und mit Ca2+ Supplementierung auf. NTNG1 zeigte nur nach Ca2+ Supplementierung eine signifikante Herunterregulierung im Gegensatz zu ATF3, EGFL6, MITF und PAPLN, die nur ohne Ca2+-Supplementierung, nach siRNA Behandlung gegen PAX6 eine signifikante Herunterregulierung aufwiesen. ABI3BP, PXDN sowie SLITRK4 waren in diesem Versuch nicht signifikant verändert. CCK und LRRN1 wurden signifikant in Abwesenheit von Ca2+ nach siRNA Behandlung gegen PAX6 hochreguliert. Schlussfolgerung: Nicht alle Transkripte des Zellmodells haben sich entsprechend der Patientendaten in unserem Versuch verhalten. Bei Transkripten wie TMEM47, das zur Zell-Junctions/ -Adhesionen dient, spielt der Differenzierungsgrad keine Rolle. Bei TGFBI, das einen Einfluss auf den Aufbau der Zellmatrix hat, scheint der Einfluss von PAX6 bei einen niedrigeren Differenzierungsgrad stärker zu sein. Bei TGFBI, TMEM47, CRYAB, und NTNG1, die sich entsprechend den Patientendaten in unseren Versuch verhalten haben, ist die Wahrscheinlichkeit einer Regulierung durch PAX6 hoch. Bei allen anderen Genen, die ein abweichendes Verhalten zeigen, ist die alleinige Regulierung durch PAX6 unwahrscheinlich.

Summary Purpose: It could be shown in preliminary works [39,40] that the expression of a wide variety of genes was reduced in aniridia patients, both in conjunctival epithelial cells and limbal epithelial cells. A regulation of these genes’ transcripts by PAX6 is suspected. This work attempts to determine, whether the mRNA expression of these genes act similarly in an aniridia cell model, based on pure PAX6 mRNA down-regulation, as in aniridia patients. The aim is to clarify, whether the observed mRNA expression of these genes is regulated by PAX6 or depends on other external factors. Methods: By harvesting healthy limbal epithelial cells from donor corneas and treating them with siRNA targeting PAX6 in cell culture, the conditions of PAX6-associated aniridia were mimicked. In addition, some cultures were also treated with Ca2+, in order to compare gene expression at different degrees of epithelial cell differentiation. SYBR-green qPCR was used in order to test, to which extent the mRNA expression of the genes TGFBI, TMEM47, CRYAB, NTNG1, EGFL6, PAPLN, ABI3BP, SLITRK4, CCK, LRRN1, ATF3, MITF, PXDN is affected in the cell models, depending on PAX6 knockdown status. Following siRNA treatment, PAX6 protein levels were determined using Western blot. Results: TGFBI, TMEM47 and CRYAB mRNA expression, showed a highly significant downregulation after siRNA treatment against PAX6 and Ca2+ supplementation. NTNG1 showed significant downregulation only after Ca2+ supplementation, in contrast to ATF3, EGFL6, MITF, and PAPLN, which showed significant downregulation only without Ca2+ supplementation after siRNA treatment against PAX6. ABI3BP, PXDN, and SLITRK4 mRNA expression did not change significantly in this experiment. CCK and LRRN1 were significantly upregulated in the absence of Ca2+ after siRNA treatment against PAX6. Conclusions: Not all transcripts have shown the same behavior in our experiments as experienced earlier in patients. In TMNEM47 expression, which is involved in cell junctions/ adhesion, the grade of epithelial cell differentiation does not seem to play a role. Concerning TGFBI, which is related to cell matrix structure, PAX6 seems to play a role in less differentiated status of the cells. TGFBI, TMEM47, CRYAB, and NTNG1 expression was similar in our experiments, as in previous studies of aniridia patients, therefore, these genes are most probably regulated by PAX6. All other genes, with an expression other than in patients, are most probably not regulated by PAX6 only.