Investigating structural insights and inhibitor strategies in MEP pathway enzymes

Abstract

Drug-resistant infections pose a significant threat to human health with studies predicting they will become the leading cause of death in the next 30 years. There is therefore an urgent need to find new antimicrobial agents. Unfortunately, the antimicrobial drug-discovery and development pipeline is sparse, obscuring hopes of finding new drugs in the near future. The methylerythritol (MEP) pathway used mainly by pathogenic microorganisms has emerged as a source of promising new drug targets for the discovery of anti-infective agents, yet it remains underexplored. This thesis presents a comprehensive study of MEP pathway enzymes with a focus on 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXPS) and 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE) from selected pathogens. We obtained, for the first time, crystal structures of DXPS from Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae and explored their structural differences including conformational changes upon binding to the co-factor thiamine diphosphate (ThDP). These findings were instrumental in understanding how the enzyme works and how it could be inhibited. We went on to explore potential inhibition strategies against these enzymes and profiled novel classes of inhibitors, the first was thiamine monophosphate (ThMP) analogues as ThDP competitive inhibitors of DXPS, supported by binding mode analyses by obtaining a co-crystal structure with K. pneumoniae DXPS. Second, we present a promising breakthrough in DXPS inhibition by targeting an allosteric binding site and provide experimental evidence in the form of a co-crystal structure of an allosteric inhibitor with P. aeruginosa DXPS. Furthermore, we analyzed the kinetics and structural variances among IspE kinase homologs. We explored the potential impact of these structural differences on the binding mode of inhibitors, substantiating our findings through co-crystal structures with various inhibitors. This approach offers valuable insights into potential strategies for designing inhibitors. Overall, this work presents novel findings with promising potential to guide antimicrobial drug discovery targeting drug-resistant pathogens and employing underexplored enzyme inhibition approaches.

Arzneimittelresistente Infektionen stellen eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Studien prognostizieren, dass sie in den nächsten 30 Jahren die führende Todesursache werden könnten. Daher besteht ein dringender Bedarf, neue antimikrobielle Wirkstoffe zu entdecken. Leider ist die Pipeline für die Entdeckung und Entwicklung antimikrobieller Medikamente dünn gesät, was die Hoffnung auf die baldige Entdeckung neuer Medikamente trübt. Der Methylerythritol (MEP)-Weg, der hauptsächlich von pathogenen Mikroorganismen genutzt wird, hat sich als vielversprechende Quelle neuer Wirkstoffziele für die Entdeckung von antiinfektiven Substanzen erwiesen, bleibt jedoch unterexploriert. Diese Dissertation präsentiert eine umfassende Studie zu Enzymen des MEPWegs mit Schwerpunkt auf 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (DXPS) und 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol-Kinase (IspE) aus ausgewählten Pathogenen. Zum ersten Mal erhielten wir Kristallstrukturen von DXPS aus Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae und erforschten ihre strukturellen Unterschiede, einschließlich konformationeller Veränderungen bei der Bindung an den Cofaktor Thiamindiphosphat (ThDP). Diese Erkenntnisse waren entscheidend, um zu verstehen, wie das Enzym funktioniert und wie es gehemmt werden könnte. Wir untersuchten dann potenzielle Hemmstrategien gegen diese Enzyme und profilten neuartige Klassen von Inhibitoren. Die erste umfasste Thiaminmonophosphat (ThMP)-Analoga als ThDP-konkurrenzfähige Inhibitoren von DXPS, unterstützt durch Bindungsmodusanalysen durch Erlangen einer Co-Kristallstruktur mit K. pneumoniae DXPS. Zweitens präsentieren wir einen vielversprechenden Durchbruch in der Hemmung von DXPS durch die Ausrichtung auf eine allosterische Bindungsstelle und liefern experimentelle Beweise in Form einer Co-Kristallstruktur eines allosterischen Inhibitors mit P. aeruginosa DXPS. Darüber hinaus analysierten wir die Kinetik und strukturellen Unterschiede zwischen IspE-Kinase-Homologen. Wir erforschten das potenzielle Auswirkungen dieser strukturellen Unterschiede auf den Bindungsmodus von Inhibitoren und untermauerten unsere Erkenntnisse durch Co-Kristallstrukturen mit verschiedenen Inhibitoren. Dieser Ansatz bietet wertvolle Einblicke in potenzielle Strategien zur Gestaltung von Inhibitoren. Insgesamt präsentiert diese Arbeit neuartige Erkenntnisse mit vielversprechendem Potenzial, die antimikrobielle Wirkstoffentwicklung zur Bekämpfung von resistenten Pathogenen zu lenken und unterexplorierte Ansätze zur Enzymhemmung zu nutzen.