Etablierung eines Verfahrens zur gezielten Anreicherung von Exosomen aus liquid biopsies von Patienten mit diagnostiziertem klarzelligen Nierenzellkarzinom

Abstract

Unter den Tumorerkrankungen repräsentieren die oft tödlich verlaufenden urologischen Tumore eine Entität mit einem erheblichen Anteil. Extrazelluläre Vesikel eröffnen als innovative Biomarker die besten Chancen zu einer frühzeitigen Erkennung und dann zielgerichteten Behandlung solcher Tumore. Exosomen stellen hierbei eine wichtige Untergruppe der Extrazellulären Vesikel dar. Von diesen ist bekannt, dass sie eine aktive Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation spielen, und über Proteine und Nukleinsäuren an der Zellprägung sowie der Kontrolle der Zellaktivität beteiligt sind. Ihr Potenzial liegt in ihrer Bioverfügbarkeit in allen Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel etc, und sie werden von fast allen Zelltypen ausgeschieden. Zudem spiegelt ihre molekulare Zusammensetzung ihre Herkunft wider, so lassen sie sich theoretisch ihrem Ursprung wie Tumorgewebe oder Normalgewebe zuordnen. Allerdings wurden bisher keine für die Diagnostik von Nierenzellkarzinomen nutzbaren Biomarker beschrieben. Zum anderen sind Exosomen, die von solchen Tumoren sezerniert werden, in den diagnostisch nutzbaren Körperflüssigkeiten nur in sehr geringer Konzentration vorhanden. Weiterhin befinden sich in Körperflüssigkeiten noch eine Vielzahl an Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und Vesikeln/Partikeln, die von anderen Quellen kommen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Proteine zu identifizieren, die sich nachweislich dem klarzelligen Nierenzellkarzinom zuordnen lassen und auf Exosomen vorhanden sind. Diese Tumormarker sollen dazu verwendet werden, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem sich Exosomen solcher Tumore, gezielt aus dem Blut oder Urin anreichern lassen. Die vorliegende Arbeit dokumentiert die erfolgreiche Isolation von Exosomen aus verschiedensten Quellen (Zellkultur, Gewebe und Plasma) und Entitäten (Niere, Blase, Prostata) unter Anwendung eines breiten Methodenspektrums (Ultrazentrifugation, Kits, Nano-Chips, magnetische Beads). Ein Verfahren zur Anreicherung/Isolierung von Exosomen aus Gewebe via Ultrazentrifugation mit Saccharosegradient wurde weiterentwickelt und etabliert. CD147, CA9, CD70 sind als potenzielle tumorspezifische Biomarker im Nierenzellkarzinom (NZK), in-vitro sowie in-vivo, darstellbar. Die gezielte Anreicherung von Exosomen mittels magnetischer Beads, die mit exosomalen (CD63) oder tumoralen (CD147) Antikörpern gekoppelt waren, konnte im in-vitro Modell in der Zellkultur erfolgreich etabliert werden. Hier zeigten sich unterschiedliche Expressionsmuster auf den CD63-positiven und den CD147-postiven Subpopulationen. Die Kolokalisation des Tumormarkers CD147 und der Exosomenmarker CD9, CD63, CD81 auf den CD9-positiven, CD63-positiven oder CD81-positiven Subpopulationen wurde unter Verwendung eines Nano-Chips in-vitro (Zellkultur) und in-vivo (humanes Blutplasma) quantifiziert. Aufbauend auf diesen Daten kann auf der Ebene von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren eine weitere Charakterisierung der Exosomensubpopulationen erfolgen. Die Einbindung innovativer, hochauflösender Techniken erlaubt darauf aufbauend die Entwicklung einer Reihe von Markern zur diagnostischen und therapeutischen Implementierung von Exosomen in der Tumorbehandlung.

In developed societies, tumors are among the most common diseases which eventually lead to death. Improvements in diagnostics and therapy have been the focus of numerous research projects for many decades. Urological cancers represent a large proportion of tumor diseases. Early detection and targeted treatment offer the best chance of successfully combating the disease. Extracellular vesicles can fulfil these requirements as innovative biomarkers. Exosomes, a subgroup of extracellular vesicles, are known to play an active role in cell-to-cell communication and to be involved in cell imprinting and the control of cell activity via proteins and nucleic acids. The great medical potential lies in their bioavailability, as they are found in all body fluids like blood, urine, or saliva and are excreted by almost all cell types. In addition, their molecular composition reflects their origin, so they can theoretically be assigned to their cell of origin (e.g. tumor tissue or normal tissue). However, no biomarkers that can be used for diagnostics in ccRCC have been described to date. On the other hand, in the body fluids that can be used for diagnostic purposes (e.g. urine, blood), exosomes that explicitly originate from urological tumor cells are only present in very low concentrations. Furthermore, there are a large number of proteins, lipids, nucleic acids and vesicles/particles in body fluids, which may originate from other sources. The aim of this study was to identify proteins that can be proven to be associated with clear cell renal cell carcinoma. These tumor markers should be used to develop a method with which exosomes secreted by a clear cell RCC can be selectively enriched from the blood or urine. This work describes the successful isolation of exosomes from different sources (cell culture, tissue and plasma) and entities (kidney, bladder, prostate) using a wide range of methods (ultracentrifugation, kits, nano-chips, magnetic beads). A known method for enriching/isolating exosomes from tissue via ultracentrifugation through a sucrose gradient was improved and established. CD147, CA9, CD70 were identified as potential tumor-specific biomarkers in renal cell carcinoma (RCC), both in-vitro and in-vivo. The enrichment of exosomes using magnetic beads coupled with exosomal (CD63) or tumor-specifc (CD147) antibodies was successfully established in an in-vitro model in cell culture. Here, different expression patterns were found on the CD63-positive and the CD147-positive subpopulations. The colocalization of the tumor marker CD147 and the exosome markers CD9, CD63, CD81 on the CD9-positive, CD63-positive or CD81-positive subpopulations was quantified in vitro (cell culture) and in vivo (human blood plasma) using a nanochip. Based on these data, the further characterization of the exosome subpopulations on the level of proteins, lipids and nucleic acids is envisioned. The integration of innovative, high-resolution techniques allows the development of a marker panel for the diagnostic and therapeutic implementation of exosomes in tumor therapy.