Untersuchung der Wirkung von TLR-Liganden auf die Differenzierung von 3D-Bronchosphären

Abstract

Infektionen des Respirationstrakts tragen maßgeblich zur Verschlechterung von Lungenerkrankungen wie der Mukoviszidose (CF) und der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) bei. CF-Erkrankte leiden häufig unter chronischen Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa, während Haemophilus influenzae bei Menschen mit COPD wiederholt akute und chronische Infektionen der Lunge verursacht. Darüber hinaus lösen virale Infektionen akute Verschlimmerungen (Exazerbationen) bei COPD-Patienten und -Patientinnen aus. Bei Lungenorganoiden handelt es sich um selbstorganisierende Strukturen, die sich aus Vorläuferzellen des Lungenepithels bilden und dreidimensional kultiviert werden. Organoide bilden verschiedene Aspekte der Zellzusammensetzung, 3D-Architektur und Funktion von Organen ab. In den letzten Jahren haben sich Organoide zunehmend als geeignete Methode zur Untersuchung von Erkrankungen herausgestellt, vor allem als Alternative zu Tierversuchen. In den vergangenen Jahren wurden Protokolle publiziert, die es erlauben Bronchosphären aus Basalzellen zu differenzieren. Solche Bronchosphären sind aus Basalzellen, Zilienzellen sowie Becherzellen aufgebaut und verfügen über ein Lumen. Ziel dieser Arbeit war es, die Kultivierung sowie eine Methodik zur Analyse von Bronchosphären zu etablieren. Folgend sollte untersucht werden, wie sich bestimmte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), welche als Liganden für Toll-like Rezeptoren (TLRs) dienen, auf die Differenzierung von Basalzellen zu Bronchosphären auswirken. Hierfür wurden die Bron-chosphären während der Differenzierungsphase mit dem synthetischen Lipopeptid Pam3CSK4, der synthetischen doppelsträngigen RNA Poly(I:C), bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) und Flagellin aus P. aeruginosa behandelt. Im ersten Teil der Arbeit wurden Protokolle zur Kultivierung von Bronchosphären und ihrer histologischen Analyse etabliert. Mittels Übersichtsfärbungen sowie Fluoreszenz- und immunhistochemischen Färbungen konnten Zilienzellen, Basalzellen und sekretorische Zellen in einer Vielzahl an Organoiden je Kulturbedingung unterschieden werden. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung der Bronchosphären mit Flagellin, ein Virulenzfaktor begeißelter Bakterien wie P. aeruginosa und Ligand für TLR5, zu einer Hemmung der Bildung von Zilien, einer verminderten Lumenausbildung, sowie einer signifikant verstärkten Mukusbildung führt. Unter Behandlung mit Pam3CSK4, Ligand für TLR1/2, konnte ebenfalls eine signifikant gesteigerte Mukusproduktion festgestellt werden, während die Ziliogenese jedoch nicht signifikant beeinflusst wurde. Die Stimulation mit LPS und Poly(I:C) führte zu einer Spender-abhängigen gesteigerten Bildung von Muzinen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine fortdauernde Aktivierung des respiratorischen Epithels durch bakterielle Faktoren wie Flagellin über TLRs, maßgeblich zu einer übermäßigen Mukusbildung und Becherzellhyperplasie bei Patienten und Patientinnen mit chronischen Lungenerkrankungen führt. Ständige Exposition mit mikrobiellen Faktoren begünstigt die Differenzierung von Basalzellen hin zu sekretorischen Zellen, was mit einer Hemmung der Ausbildung an Zilienzellen einhergeht. Dies trägt möglicherweise bei der COPD und CF zu einer eingeschränkten mukoziliären Clearance und einem Teufelskreis aus geschwächter Abwehr in der Lunge und Infektionen bei. Zukünftige Studien könnten hierauf aufbauend das Organoid-System für die Testung potenzieller Wirkstoffe, welche die Zelldifferenzierung und die Mukusbildung adressieren, sowie die Aufklärung hiermit verbundener zellulärer Signalwege nutzen. Derartige Organoid-Modelle bie-ten darüber hinaus durch die Gewinnbarkeit humaner Zellen im Rahmen von Routineuntersuchungen, beispielsweise bei Lungenspülungen, neue Möglichkeiten im Hinblick auf die personalisierte Medizin.

Respiratory tract infections essentially contribute to the worsening of lung disease like cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). CF patients often suffer chronic Pseudomonas aeruginosa infections, while Haemophilus influenzae repeatedly induces acute and chronic infections in COPD patients. Moreover, viral infections cause acute aggrava-tion (exacerbations) in patients with COPD. Lung organoids are self-organizing structures which develop from progenitor cells of the lung epithelium and are cultivated in 3D. Organoids represent various aspects of cellular composition, 3D architecture and function of organs. In the last years, organoids have become an increasingly suitable method for the study of disease, especially as an alternative to animal testing. In the past years, protocols showing the differentiation of bronchospheres from basal cells have been published. These bronchospheres consist of basal cells, ciliated cells, goblet cells and a lumen. The aim of this doctoral thesis was to establish the cultivation and a methodology for the analysis of bronchospheres. It was examined how certain pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which function als ligands for Toll-like receptors (TLRs), influence the differentiation of basal cells to bronchospheres. Therefore, bronchospheres were treated with the synthetic lipopeptide Pam3CSK4, the synthetic double stranded RNA Poly(I:C), bacterial lipopolysaccharides (LPS) and flagellin from P. aeruginosa within the differentiation phase. In the first part of the thesis protocols for the cultivation and histological analysis of bronchospheres were established. By overview staining, fluorescence and immunohistochemical staining it was possible to distinguish ciliated cells, basal cells and secretory cells in a variety of organoids per culture condition. It was shown that the treatment of bronchospheres with flagellin, a virulence factor of flagellated bacteria like P. aeruginosa and ligand for TLR5, leads to an inhibition of cilia development, a decreased formation of lumina and an increased production of mucus. Under treatment with Pam3CSK4, a ligand for TLR1/2, the mucus production likewise was significantly increased, while the ciliogenesis was not significantly influenced. The stimulation with LPS and Poly(I:C) led to a donator dependent increased expression of mucins. The results of this thesis indicate that a continuous activation of the respiratory epithelium by bacterial factors such as flagellin via TLRs leads to an excessive mucus production and goblet cell hyperplasia in patients with chronic lung disease. Persistent exposure to microbial factors favors the differentiation of basal cells to secretory cells and suppresses the development of ciliated cells. This possibly contributes to an impaired mucociliary clearance and a vicious circle of weakened defense and infections in patients with COPD and CF. Based on this, future studies could use the organoid system to test potential drugs that address cell differentiation and mucus formation as well as to eludicate associated cellular signaling pathways. In addition, these organoid models offer new possibilities in personalized medicine, as human cells can easily be obtained in routine diagnostics such as lung lavage.