Charakterisierung der Lphn2- und Lphn3-Expression in genetisch veränderten Reporter-Mäusen

Abstract

The aim of our research was to map out the Lphn content of extraneuronal tissues. The Lphn were discovered in studies about α-latrotoxin, the poison of the black widow spider (latrodectus mactans) and are part of the aGPCR subfamily [19]. In general the GPCR family is one of the most widespread receptors in nature and has multiple functi- ons as receptors for neurotransmitters, hormones and cytokines [33]. In addition, they are the target for nearly 60% of pharmacological interventions [46]. But there are also some poorly understood GPCRs called orphan GPCRs. Some of these orphan receptors are the Lphns. These were mainly studied in neuronal tissue, because of the interaction with the neurotoxin of Latrodectus mactans [20]. Subsequent studies put Lphn2 into context with deseases of the lung, e.g., COPD [36], squamous cell cancinoma [56] and immunological disorders like common variable immunodeficiency (CVID) or juvenile idiopathic athritis (JIA) [31]. Lphn3 could be assosiated with bronchial asthma [15] [34], adenocarcinoma of the lung [23] and diabetes mellitus [41]. Thus, the study of Lphns in extraneuronal tissues is appropriate. To achieve this we investigate the Lphns on all levels of molecular expression. First, we analyzed the DNA of genetic modified reporter mice. Due to a lack of established antibodies for Lphns, the modification through GFP/HA-tagging had to be ensured. In a second step, the transcriptionlevel of Lphn in the selected tissues had to be confirmed by qRTPCR. In the case of Lphn2 we found large quantities in the tissues of heart, liver, kidney, brain, retina, spinal cord and tongue. In the case of Lphn3 we discovered high transcriptlevels in kidney, spinal cord, retina, brain and lung. In addition, immunoblotting has been used to confirm the presence of Lphn2. In this case, we could confirm the presence of Lphn2 in brain, liver, kidney and Lphn3 in brain and lung [5]. As the appearance of Lphn2 in tongue was not described in previous studies [18] we decided to explore the tissue of the tongue by histological examination via immunohisto-chemistry. In those studies we confirmed the presence of Lphn2 protein at the basis of the papillae filiformis of the tongue. The function of Lphn2 in this case as a part of the mechanosensory transmission of haptic stimulation is up to further investigation. Studies in Drosophila melanogaster have demonstrated an involvement of dCIRL, the Drosophila melanogaster homolog of Lphn as a potential mechanosensor [44] [14]. It would also be interesting to apply the- se methods to other organ systems with sensorimotor components such as the kidneys, vascular system, liver or heart [45] [33]. Furthermore by using the mapping of Lphn and the kowledge about dysregulations in the context of diseases, new research approaches open up. Considering the pharmacological potential of the GPCR described above [46], further investigation of the Lphn would be of interest for the development of pharmaco- logical interventions. Moreover, based on the results of the screening via qRT-PCR on all possible splice variants of the Lphn it is necessary to investigate specific variants of the Lphn. By using specific assays of these variants, it would be possible to study the Lphn and their sybtypes in more detail. At last, the localisation of Lphn2 needs to be defined more precisely by utilising improved detection methods. Due to the limited resolution of the immunohistochemistry used in this work, it is essential to carry out further investiga- tions via immunofluorescence analysis at the base of the papillae filiformis using special microscopes and filters.

Diese Arbeit widmet sich der Kartierung extraneuronaler Gewebe bezuüglich ihrer Lphn-Expression. Die Latrophiline (kurz: Lphn), die im Zusammenhang mit dem Gift der schwarzen Witwe (Latrodectus mactans) entdeckt wurden, zählen zur Subfamilie der aGPCR [18]. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (kurz: GPCR) im Allgemeinen stellen eine der größten bekannten Rezeptorklassen dar und haben auf vielfältige Arten Bedeutung als Rezeptoren fuür Neurotransmitter, Hormone und Cytokine [33]. Dadurch dienen die GPCR mittlerweile als Ziel für 60% der Pharmakotherapie [46]. Unter den GPCR gibt es jedoch einige wenig erforschte Vertreter, die man Waisen-GPCR (engl.: orphan-GPCR) nennt. Vertreter dieser Waisen-GPCR sind die Latrophiline. Diese wurden in ersten Arbeiten vor allem in neuronalem Gewebe erforscht, da man einen Zusam- menhang zwischen dem Nervengift α-Latrotoxin und den Latrophilinen erkannte [20]. In Folgearbeiten konnte für die Lphn durchaus eine klinische Relevanz über die der Neurotransmission hinaus aufgezeigt werden. Beispielsweise wird Lphn2 mit pulmonalen Erkrankungen wie chronische Bronchitis (kurz: COPD, engl.: chronic obstructive pulmonal disease) [36] und dem Plattenepithelkarzinom der Lunge [56] sowie mit immunologischen Störungen wie Allgemeiner variabler Immundefekt (kurz: CVID, engl.: common variable immunodeficiency) und juveniler idiopathischer Arthritis [31] in Verbindung gebracht. Für Lphn3 konnte darüber hinaus ein Zusammenhang mit Erkrankungen wie Asthma bronchiale [15] [34], dem pulmonalen Adenocarzinom [23] oder Diabetes mellitus [41] hergestellt werden. Dies veranlasst uns zur genaueren Untersuchung der GPCR in extraneuronalen Geweben. Hierzu werden in dieser Arbeit die Latrophiline auf mehreren Ebenen der Molekülexpression beleuchtet. Als Ausgangsmaterial dienen Gewebe von genetisch modifizierten Reportermäusen, deren Lphn-Gene mittels LoxP/FRT-Sequenzen (engl.: locus of X-over P1/ flippase recognation target) flankiert sind. Im ersten Schritt werden die Desoxy- ribonukleinsäuren (kurz: DNS) dieser Mäuse mittels Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR, engl.: polymerase chainc reaction) untersucht. Somit wird sichergestellt, dass diese homo- oder heterozygote Erbträger der genetischen Modifikation sind. Dies ist wichtig, da es keine etablierten Antikörper gegen die Latrophiline selbst, sondern lediglich gegen an Lphn angeheftete Markermoleküle gibt. Im nächsten Schritt wird der Nachweis auf transkriptioneller Ebene geführt, indem mittels quantitativer Reverse-Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion (kurz: qRT-PCR, engl.: reverse transcriptation polymerase chain reaction) mehrere Gewebe der modifizierten Mäuse gescreent werden. So gelingt die Identifikation großer Lphn2-Transkriptmengen in den Geweben Herz, Leber, Niere, Gehirn, Retina, Rückenmark und Zunge. Darüber hinaus sind in den Geweben der Retina, Niere, Lunge und des Rückenmarks große Lphn3-Transkriptmengen zu finden. Daraufhin erfolgt in ausgewählten Geweben der qualitative Nachweis der Lphn im Immunoblot. Hier können wir die Lokalisation von Lphn2 in Hirn-, Leber-, Nieren- und Zungengewebe und jene von Lphn3 in Hirn- und Lungengewebe bestätigen [5]. Neu und demnach nicht vorbeschrieben ist die Präsenz von Lphn2 in der Zunge [18]. Aufgrund dessen führen wir im Rahmen dieser Arbeit explorativ histologische Untersuchungen an Zungengewebe von Lphn2-mVenus positiven und Lphn2-mVenus negativen Mäusen durch. Hier zeigen sich positive Signale in der Immunhistochemie an der Basis der Papillae filiformis von Lphn2-mVenus positiven Mäusen, nicht jedoch an den Proben der Lphn2-mVenus negativen Kontrollgruppen. Somit gelingt der Nachweis von Lphn2 im basalen Bereich der Fadenpapillen der Zunge. Aufbauend auf diesen Ergebnissen ergeben sich somit zusätzliche Möglichkeiten zur weiterführenden Erforschung der Lphn. Zum einen geht aus Arbeiten an Drosophila melanogaster hervor, dass dCIRL (der Vertreter der Lphn in Drosophila melanogaster) in Zusammenhang mit der sensomechanischen Kopplung steht [44] [14]. Aufgrund der Funktion der Papillae filiformis als Sinnesorgan für taktile Reize [12] [33] [45] könnte somit Lphn2 als Rezpetor der sensomechanischen Reizweiterleitung in weiteren Arbeiten diskutiert werden. Ebenfalls interessant wäre diese Methoden auf andere Organsysteme mit sensomotorischer Komponente wie Nieren, Gefäßsystem, Leber oder Herz [45] [33] zu erweitern. Zum anderen eröffnen sich mit Hilfe der durch diese Arbeit erfolgte Lphn-Kartierung und der Erkenntnisse u ̈ber Dysregulationen im Rahmen von Erkrankungen neue Forschingsansätze. In Anbetracht des oben beschriebenen pharmakologischen Po- tentials der GPCR [46] wäre eine weiterführende Untersuchung der Lphn interessant für die Entwicklung pharmakologischer Interventionen. Des Weiteren ergibt sich aufbauend auf den Ergebnissen aus dem qRT-PCR-Screening auf alle putativen Spleißvarianten der Lphn die Notwendigkeit zur Untersuchung spezifischer Lphn-Varianten. Mithilfe spezifischer Assays für die Gene dieser Varianten wäre es möglich, die Lphn und deren Sybtypen genauer zu untersuchen. Letzlich ist es notwendig, mit Hilfe verbesserter Nachweismetho- den die Lokalisation von Lphn2 genauer zu definieren. Aufgrund des limitierten Auflösungsvermo ̈gens der in dieser Arbeit verwendeten Immunhistochemie ist es erforderlich, mit Hilfe von Spezialmikroskopen und Filtern Untersuchungen via Immunfluoreszens an der Basis der Papillae filiformis durchzuführen. Insgesamt betrachtet ergibt sich aus den Erkentnissen dieser Arbeit ein besseres Verständis für die Lphn und erleichtert somit die weiterführende Erforschung ihrer Funktion, ihrer Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen, ihres Zusammenhangs mit Erkrankungen und ihres Potentials als Ziel pharmakologischer Interventionen.