Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for extended substrate utilization in biorefinery applications

Abstract

C. glutamicum is a robust industrial workhorse for chemical production. However, due to its narrow substrate spectrum, the microbe is mainly applied on using first-generation edible crops, unfavorably competing with food supply. In this regard, the present work aimed at systems metabolic engineering of C. glutamicum towards an extended substrate spectrum. Starting from the wild type, several rounds of optimization genomically introduced and evaluated various catabolic sugar modules. Ultimately, this provided a multi-substrate-use cell factory, designated C. glutamicum MSU8-B. The novel strain co-consumed glucose and fructose together with various second-generation sugars, such as mannose, xylose, L-arabinose, galactose, and L-rhamnose. MSU-8B, furthermore, harnessed all six sugars contained in spent sulfite liquor (SSL), a global industrial waste stream from the pulp and paper industry, providing a milestone towards biorefinery applications of the microbe. Afterwards, the sugar modules were successfully transferred into the genome-based cell factory C. glutamicum GTA-4, enabling production of up to 30 g L-1 of the plastic monomer glutarate from SSL in a fed-batch process. Furthermore, variants with a streamlined substrate spectrum which consumed all substrates except one enabled the recovery of single high-value sugars from SSL.C. glutamicum is a robust industrial workhorse for chemical production. However, due to its narrow substrate spectrum, the microbe is mainly applied on using first-generation edible crops, unfavorably competing with food supply. In this regard, the present work aimed at systems metabolic engineering of C. glutamicum towards an extended substrate spectrum. Starting from the wild type, several rounds of optimization genomically introduced and evaluated various catabolic sugar modules. Ultimately, this provided a multi-substrate-use cell factory, designated C. glutamicum MSU8-B. The novel strain co-consumed glucose and fructose together with various second-generation sugars, such as mannose, xylose, L-arabinose, galactose, and L-rhamnose. MSU-8B, furthermore, harnessed all six sugars contained in spent sulfite liquor (SSL), a global industrial waste stream from the pulp and paper industry, providing a milestone towards biorefinery applications of the microbe. Afterwards, the sugar modules were successfully transferred into the genome-based cell factory C. glutamicum GTA-4, enabling production of up to 30 g L-1 of the plastic monomer glutarate from SSL in a fed-batch process. Furthermore, variants with a streamlined substrate spectrum which consumed all substrates except one enabled the recovery of single high-value sugars from SSL.

C. glutamicum ist ein robustes industrielles Arbeitspferd für die chemische Produktion. Aufgrund seines schmalen Substratspektrums wird die Mikrobe jedoch hauptsächlich auf essbaren Pflanzen der ersten Generation eingesetzt, was eine ungünstige Konkurrenz für die Lebensmittelversorgung darstellt. Vor diesem Hintergrund zielte die vorliegende Arbeit darauf ab, den Stoffwechsel von C. glutamicum auf ein erweitertes Substratspektrum umzustellen. Ausgehend vom Wildtyp wurden in mehreren Optimierungsrunden verschiedene katabole Zuckermodule genomisch eingeführt und bewertet. Dies führte schließlich zu einer Zellfabrik mit mehreren Substraten, die als MSU8-B bezeichnet wurde. Der neuartige Stamm verbrauchte Glucose und Fructose zusammen mit Zuckern der zweiten Generation, wie Mannose, Xylose, L-Arabinose, Galactose und L-Rhamnose. MSU-8B nutzte darüber hinaus alle sechs Zucker, die in verbrauchter Sulfitablauge (SSL), einem industriellen Abfallstrom aus der Zellstoff- und Papierindustrie, enthalten sind, was einen Meilenstein in Richtung Bioraffinerieanwendungen der Mikrobe darstellt. Anschließend wurden die Zuckermodule erfolgreich in die genombasierte Zellfabrik GTA-4 übertragen, was die Produktion von bis zu 30 g L-1 des Kunststoffmonomers Glutarat aus SSL in einem Fed-Batch-Prozess ermöglichte. Darüber hinaus ermöglichten Varianten mit einem gestrafften Substratspektrum, die alle Substrate bis auf eines verbrauchten, die Gewinnung von hochwertigen Einzelzuckern aus SSL.C. glutamicum ist ein robustes industrielles Arbeitspferd für die chemische Produktion. Aufgrund seines schmalen Substratspektrums wird die Mikrobe jedoch hauptsächlich auf essbaren Pflanzen der ersten Generation eingesetzt, was eine ungünstige Konkurrenz für die Lebensmittelversorgung darstellt. Vor diesem Hintergrund zielte die vorliegende Arbeit darauf ab, den Stoffwechsel von C. glutamicum auf ein erweitertes Substratspektrum umzustellen. Ausgehend vom Wildtyp wurden in mehreren Optimierungsrunden verschiedene katabole Zuckermodule genomisch eingeführt und bewertet. Dies führte schließlich zu einer Zellfabrik mit mehreren Substraten, die als MSU8-B bezeichnet wurde. Der neuartige Stamm verbrauchte Glucose und Fructose zusammen mit Zuckern der zweiten Generation, wie Mannose, Xylose, L-Arabinose, Galactose und L-Rhamnose. MSU-8B nutzte darüber hinaus alle sechs Zucker, die in verbrauchter Sulfitablauge (SSL), einem industriellen Abfallstrom aus der Zellstoff- und Papierindustrie, enthalten sind, was einen Meilenstein in Richtung Bioraffinerieanwendungen der Mikrobe darstellt. Anschließend wurden die Zuckermodule erfolgreich in die genombasierte Zellfabrik GTA-4 übertragen, was die Produktion von bis zu 30 g L-1 des Kunststoffmonomers Glutarat aus SSL in einem Fed-Batch-Prozess ermöglichte. Darüber hinaus ermöglichten Varianten mit einem gestrafften Substratspektrum, die alle Substrate bis auf eines verbrauchten, die Gewinnung von hochwertigen Einzelzuckern aus SSL.