Metabolic and regulatory network analysis of DHA-producing recombinant Yarrowia lipolytica

Abstract

Heterologous expression of myxobacterial PKS-like PUFA cluster in recently created recombinant Yarrowia lipolytica Af4 strain allowed formation of DHA, polyunsaturated fatty acid with significant impact on human health. The focus of this work was to unravel the complex underlying metabolism of the oleaginous yeast using systems biology tools. Growth-decoupled production of DHA occurred during the stationary phase. The transition triggered drastic changes in global transcription and reduced availability of the two DHA precursors, acetyl and malonyl-CoA up to 98%. Upregulation of genes belonging to PUFA cluster coincided with the activated degradation of lipid bodies and fatty acids and the associated glyoxylate shunt, reactions involved in cellular stress-response, and interestingly, catabolic routes of branched-chain amino acids and L-lysine. This inspired the creation of time-resolved feeding strategies that supplemented the cultures with citrate, L-lysine, L-leucine and L-isoleucine, respectively to provide additional acetyl-CoA. Beneficially, the novel strategy increased DHA production up to 38%. Careful 13C tracer studies then unraveled that the supplemented carbon was significantly incorporated into intracellular CoA-esters, amino acids, and DHA itself. Fed by small amounts of L-lysine, the recombinant producer Y. lipolytica Af4 accumulated DHA up to the gram scale in the fed-batch process, and surpassed previous efforts three-fold.

Die heterologe Expression eines myxobakteriellen PUFA-Clusters in dem kürzlich geschaffenen rekombinanten Yarrowia lipolytica Af4 ermöglichte die Synthese von DHA, einer mehrfach ungesättigten Fettsäure mit erheblichen Auswirkungen auf die Gesundheit. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Aufklärung des komplexen zugrunde liegenden Stoffwechsels der öligen Hefe mit systembiologischen Methoden. Die Produktion von DHA erfolgte wachstumsentkoppelt in der stationären Phase. Der Übergang löste drastische Veränderungen in der globalen Transkription aus und verringerte die Verfügbarkeit der beiden DHA-Vorstufen Acetyl- und Malonyl-CoA um bis zu 98%. Die Hochregulierung des PUFA-Clusters, fiel mit dem aktivierten Abbau von Lipiden und dem damit verbundenen Glyoxylat-Shunt, mit verstärkter Stressreaktion, und interessanterweise auch mit katabolen Wegen von verzweigtkettigen Aminosäuren und L-Lysin zusammen. Dies inspirierte zur Entwicklung von zeitaufgelösten Fütterungsstrategien, bei denen Citrat, L Lysin, L Leucin bzw. L Isoleucin zugeführt wurden, um zusätzliches Acetyl-CoA bereitzustellen. Mit dieser neuen Strategie konnte die DHA-Produktion um bis zu 38% gesteigert werden. 13C-Tracer-Studien ergaben, dass der zugeführte Kohlenstoff in großem Umfang in CoA-Ester, Aminosäuren und DHA eingebaut wurde. Im Fed-Batch-Verfahren produzierte Y. lipolytica Af4, der mit geringen Mengen L Lysin gefüttert wurde, DHA bis in den Grammbereich und übertraf frühere Ansätze um das Dreifache.