Veränderungen von Expressionsmustern auf Transkriptomebene, auf Ebene der post-transkriptionellen Regulation durch miRNAs und auf Proteinebene in Spermien von Männern mit Infertilitäts-assoziierten Anomalien

Abstract

Infertilität ist weit verbreitetet und betrifft weltweit jedes sechste Paar. Diesen Paaren ist es nicht möglich trotz ungeschützten Geschlechtsverkehrs innerhalb eines Jahres Nachwuchs zu empfangen. Die aktuelle Forschung zeigt, dass die männliche Infertilität komplex und multifaktoriell ist und in 30 bis 40 % der Fälle idiopathisch bleibt. Auch wenn die assistierte Reproduktionstechnik trotz diagnostizierter Infertilität eines Paares eine Schwangerschaft ermöglicht, bleibt die Frage nach den Ursachen für männliche Infertilität erhalten. Zur Verbesserung unseres Verständnisses der genetischen Faktoren, die zur Entstehung männlicher Infertilität beitragen, wurde nach Veränderungen auf Proteom- und Transkriptomebene gesucht. Darüber hinaus ist die Rolle der mikroRNAs (miRNAs) als post-transkriptionelle Regulatoren von besonderem Interesse für die Aufklärung der mit Infertilität verbundenen Mechanismen. MiRNAs sind kurze, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die eine entscheidende Rolle bei der Genregulation spielen und an der Entstehung der männlichen Infertilität beteiligt sind. In dieser Arbeit habe ich mich speziell auf miRNAs und ihre Interaktionen mit Zielgenen fokussiert, um ihre Rolle bei der männlichen Infertilität zu untersuchen. Hierbei sollten molekulare Signalwege aufgedeckt werden, die bei männlicher Infertilität gestört sind und die Grundlage neuer diagnostischer Marker und maßgeschneiderter Therapien bilden könnten. Darüber hinaus habe ich eine umfassende Analyse der Veränderungen im Proteom von Spermien durchgeführt, die von Männern mit Infertilitäts-assoziierten Anomalien stammen. Hierbei sollten spezifische Proteinveränderungen identifiziert werden, die helfen zugrundeliegende Mechanismen der männlichen Infertilität zu entschlüsseln und dabei neue potentielle Biomarker zu identifizieren. Die Untersuchungen der miRNAs, ihrer Zielgene und des Proteoms sollte einen Beitrag zum besseren Verständnis der Dysregulation bei männlicher Infertilität und der männlichen Reproduktion im Allgemeinen leisten. Im Speziellen habe ich die miR-23a-3p und miR-23b-3p (miR-23a/b-3p) im Kontext der Oligoasthenozoospermie untersucht, einer Infertilitäts-assoziierten Anomalie, die durch die Reduktion der Spermienanzahl und –motilität charakterisiert ist. Ich untersuchte 16 Testis-exprimierte Zielgene, deren Interaktion mit der miR-23a/b-3p in-silico vorhergesagt wurden. Zur Identifikation der miRNA-Zielgen-Interaktionen der durch miR-23a-3p und miR-23b-3p regulierten Zielgene, habe ich einen automatisierten Luciferase-Assay durchgeführt und acht Zielgene der miR-23a-3p (NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9, G2E3, ZNF695, CEP41 und RGPD1) und drei Zielgene der miR-23b-3p (SOX6, GOLGA6C und ZNF695) identifiziert. Zur Bestätigung der direkten Interaktion zwischen den miRNAs und ihren Zielgenen, habe ich die miRNA-Bindestelle der Zielgene gezielt mutiert und somit fünf direkte Zielgene der miR 23a 3p (NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9 und CEP41) und drei direkte Zielgene der miR-23b-3p (NOL4, SOX6 und PCDHA9) bestätigt. Zur Feststellung der Expressionslevel der Zielgene der miR-23a/b-3p habe ich Spermien von Männern mit Oligoasthenozoospermie im Vergleich zu Männern mit normalen Samenparametern (Normozoospermie) mittels Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion der Expressionslevel in zehn Zielgenen (NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9, G2E3, ZNF695, CEP41, RGPD1, GOLGA6B und LMLN) bei Männern mit Oligoasthenozoospermie. Diese veränderten Expressionslevel zeigten eine positive Korrelation mit den Samenparametern, der Spermienanzahl, -motilität und –morphologie. Dies lässt vermuten, dass die Dysregulation dieser Gene mit den veränderten Samenparametern bei Oligoasthenozoospermie assoziiert ist. Darüber hinaus habe ich den Zusammenhang zwischen der miR-19a-3p und miR 19b 3p (miR-19a/b-3p) und ihre in-silico vorhergesagten, Testis-exprimierten Zielgene im Kontext der Oligoasthenozoospermie untersucht. Zur Analyse der Expressionslevel der miR 19a/b-3p und ihrer 82 Zielgene wurden Spermien von Männern mit Oligoasthenozoospermie mit Spermien von Männern mit Normozoospermie mittels quantitativer Echtzeit – Polymerase - Kettenreaktion verglichen. Die Ergebnisse zeigten die erhöhte Expression der miR-19a/b-3p und die gleichzeitige reduzierte Expression von 51 Zielgenen. Zwei Zielgene zeigten eine erhöhte Expression. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der Expressionslevel der miRNAs und der Zielgene mit den Samenparametern habe ich eine Korrelationsanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten positive Korrelationen der 51 vermindert exprimierten Zielgene mit den Samenparametern, Spermienanzahl, -motilität, und -morphologie, sowie negative Korrelationen der miR-19a-3p und miR-19b-3p mit den Samenparametern, Spermienanzahl, -motilität, -vitalität und morphologie. Außerdem wurde eine negative Korrelation zwischen der veränderten Expression der miR-19a/b-3p und den 51 Zielgenen festgestellt. Zur Validierung dieser Beobachtungen auf Proteinebene, habe ich Spermien von Männern mit Oligoasthenozoospermie im Vergleich zu Männern mit Normozoospermie mittels Western Blot untersucht. Es zeigte sich eine Reduktion der Proteinlevel zweier Gene (STK33 und DNAI1). Die Ergebnisse dieser Studie deuten auf eine mögliche Beteiligung von miR 19a/b-3p und ihren Zielgenen am Erhalt der normalen Spermienfunktion hin und legen eine regulatorische Rolle der miR-19a/b-3p in der Kontrolle der Expressionslevel ihrer Zielgene im Kontext der Oligoasthenozoospermie nahe. Des Weiteren habe ich das Spermien Proteom von Männern mit Normozoospermie, Oligoasthenozoospermie und Asthenozoospermie, die durch eine Verminderung der Spermienmotilität charakterisiert ist, analysiert. Mittels Flüssigchromatographie mit Tandem Massenspektrometrie Kopplung wurden insgesamt 4412 Proteine identifiziert, von denen 1336 Proteine in mindestens 70 % der Spermienproben gefunden wurden. Zur Analyse der differentiellen Expression der Spermienproteine, habe ich das Proteom von Spermien subfertiler Männer, d.h. Männer mit Oligoasthenozoospermie und Asthenozoospermie, mit Spermien von Männern mit Normozoospermie verglichen. Die Ergebnisse zeigten in Spermien von subfertilen Männern gegenüber Männern mit Normozoospermie eine reduzierte Expression von 32 Proteinen und eine erhöhte Expression von 34 Proteinen. Bei Männern mit Asthenozoospermie verglichen mit Normozoospermie wiesen 95 Proteine eine geringere Expression auf, während 86 Proteine eine höhere Expression zeigten. Hingegen zeigten bei Männern mit Oligoasthenozoospermie verglichen mit Normozoospermie acht Proteine eine geringere Expression und ein Protein eine höhere Expression. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen den Proteinlevel mit der Spermienmotilität sowie der Spermienanzahl habe ich eine Korrelationsanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass 13 Proteine negativ und 37 Proteine positiv mit der Spermienanzahl und 35 Proteine negativ und 20 Proteine positiv mit der Spermienmotilität korrelierten. Darüber hinaus habe ich Kombinationen aus Proteinen identifiziert, die potentiell als Biomarker für die Vorhersage männlicher Subfertilität oder die spezifische Diagnose von Asthenozoospermie und Oligoasthenozoospermie dienen könnten. Außerdem könnten identifizierte Proteine potentiell zwischen Asthenozoospermie und Oligoasthenozoospermie differenzieren und so weitere Einblicke in die unterschiedlichen molekularen Profile geben, die mit diesen Erkrankungen verbunden sind. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse meiner Forschung den regulatorischen Zusammenhang zwischen miR-23a-3p, miR-23b-3p, miR-19a-3p und miR-19b-3p und ihren jeweiligen Zielgenen bei Oligoasthenozoospermie. Darüber hinaus wurden veränderte Proteinexpressionsmuster identifiziert, die mit Subfertilität und spezifischen Infertilitäts-assoziierten Anomalien in Zusammenhang stehen. Die Korrelationsanalyse zeigte den Einfluss der entsprechenden miRNAs, der Zielgene und spezifischer Proteine auf die Spermienparameter, insbesondere auf die Spermienzahl, die Spermienmotilität und die Spermienmorphologie. Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die bei der männlichen Fortpflanzung eine Rolle spielen und der männlichen Infertilität zugrunde liegen, und können bei der Entwicklung von neuer Diagnose- und individueller Therapiestrategien helfen.

Alterations in expression patterns at the transcriptome level, at the level of posttranscriptional regulation by miRNAs, and at the protein level in sperm from men with infertility-associated impairments Infertility is widespread and affects one in six couples worldwide. These couples are unable to achieve conception within a year of unprotected sexual intercourse. Current research shows that male infertility is complex and multifactorial, and remains idiopathic in 30–40% of cases. Although assisted reproductive technology enables pregnancy even if a couple has been diagnosed with infertility, the causes of male infertility remain to be elucidated. To gain a deeper comprehension of the genetic factors contributing to male infertility, investigations have delved into changes occurring at both the proteome and transcriptome levels. Furthermore, the role of microRNAs (miRNAs) as post-transcriptional regulators has been of particular interest in elucidating the mechanisms associated with infertility. MiRNAs are small non-coding RNA molecules that play a crucial role in gene regulation, and they have been found to have potential implications in the development of male infertility. In this thesis, I have specifically focused on miRNAs and their interactions with target genes, exploring their involvement in infertility-associated impairments. The aim was to uncover molecular signaling pathways that may be disrupted in male infertility and to lay the ground for identifying new diagnostic markers and customized therapies. Additionally, I have conducted an in-depth analysis of changes occurring in the proteome of sperm samples obtained from men with infertility-associated impairments. The aim was to determine specific protein alterations, to unravel the underlying mechanisms of male infertility and to help identify new potential biomarkers. By combining investigations of miRNAs and their target genes with proteomic analyses, I aimed to deepen our understanding of the genetic intricacies involved in male infertility. Specifically, I focused on exploring the involvement of miR-23a-3p and miR-23b-3p (miR‑23a/b-3p) in the context of oligoasthenozoospermia, a condition characterized by reduced sperm count and motility. I investigated 16 testis-expressed target genes that were predicted to interact with miR-23a/b-3p. To identify the miRNA-targeting by miR-23a/b-3p, I employed an automated luciferase assay and identified eight target genes for miR-23a-3p, including NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9, G2E3, ZNF695, CEP41, and RGPD1. Additionally, three target genes, namely SOX6, GOLGA6C, and ZNF695, were identified as targets of miR-23b-3p. To confirm the direct interaction between miRNAs and their target genes, I performed mutagenesis experiments targeting the binding sites of these genes. I validated five genes (NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9, and CEP41) that were directly regulated by miR-23a-3p. Three genes (NOL4, SOX6, and PCDHA9) were directly regulated by miR-23b-3p. To assess the expression levels of the target genes, I conducted real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis on sperm samples obtained from men with oligoasthenozoospermia and compared them to samples from men with normal sperm parameters (normozoospermia). The results revealed a significant reduction in the expression levels of ten target genes, including NOL4, SOX6, GOLGA6C, PCDHA9, G2E3, ZNF695, CEP41, RGPD1, GOLGA6B, and LMLN in men with oligoasthenozoospermia. The observed differential expression levels showed a positive correlation with semen parameters, such as sperm count, motility, and morphology. This suggests that the dysregulation of these genes may play a role in the altered sperm characteristics associated with oligoasthenozoospermia. In addition, I investigated the relationship between miR-19a-3p and miR-19b-3p (miR-19a/b-3p) and their in-silico predicted testis-expressed target genes, which are associated with oligoasthenozoospermia. To analyze the expression levels of miR-19a/b-3p and its 82 predicted target genes, I performed RT-qPCR on sperm samples obtained from men with oligoasthenozoospermia in comparison to sperm from men with normozoospermia. The comparison revealed higher expression of miR-19a/b-3p and lower expression of 51 target genes. Two target genes displayed higher expression levels. To explore the relationship between the expression levels of these genes and semen parameters, I performed a correlation analysis. The findings demonstrated a positive association between the 51 target genes and semen parameters, such as sperm count, motility, and morphology. A negative correlation was observed between miR-19a/b-3p expression and sperm count, motility, vitality, and morphology. A negative correlation was also observed between miR-19a/b-3p and its 51 target genes. To validate these observations at the protein level, Western blot analysis was performed on sperm samples from men with oligoasthenozoospermia and normozoospermia. I identified reduced protein levels of two genes (STK33 and DNAI1). These findings indicate the potential involvement of miR-19a/b-3p and their target genes in maintaining normal sperm function and suggest a regulatory role of these miRNAs in controlling the expression levels of their target genes in the context of oligoasthenozoospermia. I analyzed the sperm proteome of men with normozoospermia, oligoasthenozoospermia, and asthenozoospermia, which is characterized by reduced sperm count. Using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), a total of 4412 proteins were identified. Among these, 1336 proteins were found to be present in at least 70% of the analyzed sperm samples. To analyze the differential expression of sperm proteins, I compared the proteome of sperm from subfertile men, i.e., men with oligoasthenozoospermia and asthenozoospermia, with sperm from men with normozoospermia. The results exhibited reduced expression of 32 proteins and increased expression of 34 proteins in sperm from subfertile men compared to men with normozoospermia. In the case of asthenozoospermia, 95 proteins demonstrated lower expression, whereas 86 proteins displayed higher expression. Sperm samples from men with oligoasthenozoospermia showed lower expression in eight proteins and higher expression in one protein. To investigate the relationship between protein levels and sperm motility and count, I performed a correlation analysis. The results showed that 13 proteins exhibited a negative correlation, while 37 proteins displayed a positive correlation with sperm count. Similarly, 35 proteins showed a negative correlation, and 20 proteins displayed a positive correlation with sperm motility. Moreover, I identified combinations of proteins that could potentially serve as biomarkers for generally predicting male subfertility or specifically diagnosing asthenozoospermia and oligoasthenozoospermia. Additionally, I identified proteins that potentially differentiate between astheno- and oligoasthenozoospermia, providing further insights into the distinct molecular profiles associated with these conditions. In conclusion, my research shows the association between miR-23a-3p, miR-23b-3p, miR-19a-3p, and miR-19b-3p and their respective target genes in oligoasthenozoospermia. Additionally, a proteomic analysis identified altered protein expression patterns associated with subfertility and specific subtypes of male infertility. The correlation analysis demonstrated the impact of these miRNAs, target genes, and specific proteins on semen parameters, particularly sperm count, motility, and morphology. The findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying male infertility and may help in the development of diagnostic and therapeutic strategies.