Funktionelle, bildmorphologische und histologische Analyse des murinen Kontusions- und Punktionstraumamodells

Abstract

Skelettmuskelverletzungen sind ein häufiges Krankheitsbild, insbesondere im Amateur- oder Profisport. Durch ein direktes oder indirektes Trauma wird die Muskelfunktion eingeschränkt. Neben einer Reihe etablierter Akutmaßnahmen (Pause, Eis, Kompression, Hochlagerung) existieren bisher keine kurativen, aber auch kaum evidenzbasierte symptomatische Therapiemöglichkeiten. Daher werden zur Erforschung der Muskelheilung sowie neuartiger Therapien reliable und realitätsnahe Modelle benötigt. Tiermodelle eignen sich zur multimodalen Untersuchung derzeit am besten. In dieser Arbeit wurde ein in der Literatur etabliertes Kontusions- mit einem neuartigen Punktionstraumamodell verglichen. Bisher wurde das Punktionstraumamodell noch nicht zur Untersuchung der murinen Skelettmuskelheilung genutzt. Weiter erfolgte die Erforschung der Durchführbarkeit einer Kombination aus wiederholten posttraumatischen Analysen und die Auswirkung der Traumata auf das Gangbild. Hierzu wurden 24 Mäuse in 2 Gruppen eingeteilt, wovon jeweils 12 Mäusen ein Kontusionstrauma und 12 Mäusen ein Punktionstrauma am M. gastrocnemius des linken Hinterlaufes erhielten. Das daraus resultierende Trauma und die Muskelheilung wurden posttraumatisch funktionell, bildmorphologisch und histologisch analysiert. Zur funktionellen Analyse erfolgte eine Ganganalyse per CatWalk XT 10 (Noldus, Wageningen, Niederlande) am Interventionstag und an Tag 1,4,7 und 14. Bildmorphologisch wurden sowohl MRT- Aufnahmen am Interventionstag und Tag 1,4,7 als auch sonographische Untersuchungen am Interventionstag und Tag 1,4,7,14 durchgeführt. Außerdem erfolgten an Tag 1,4,7 und 14 photoakustische in-vivo Messungen der Sauerstoffsättigung und des Hämoglobingehaltes des traumatisierten Muskels. Zur histologischen Analyse wurden an Tag 1,4,7 und 14 Standard HE-Färbungen sowie eine Immunhistochemie durchgeführt. Die Immunhistochemische Analyse erfolgte mit Antikörpern gegen CD-68, Ki-67, Myeloperoxidase und Caspase-3. In der Ganganalyse zeigten sich in beiden Gruppen posttraumatisch nur geringgradige Auswirkungen. In der Kontusionsgruppe wurde eine signifikante Verringerung der Abdruckkraft an Tag 7 beobachtet, ohne jedoch Einfluss auf das Gangbild oder die Belastung der traumatisierten Extremität zu nehmen. Die MRT-Untersuchungen konnten in beiden Gruppen Traumareaktionen nachweisen. In der Kontusionsgruppe zeigte sich ein zum Menschen analoges, „federartiges“ Hämatom sowie eine generalisierte Schwellung des traumatisierten Muskels. In der Punktionsgruppe konnte der durch das Trauma entstandene Stichkanal gezeigt werden. Im Zeitverlauf zeigte sich die Schwellung des traumatisierten Muskels in der Kontusionsgruppe bis Tag 7, in der Punktionsgruppe bis Tag 4 sukzessive rückläufig. Sonographisch wurden Schwellungen des traumatisierten Muskels in beiden Gruppen nachgewiesen. Das intramuskuläre Hämatom konnte in der Kontusionsgruppe ebenfalls partiell dargestellt werden. In der Punktionsgruppe konnte das Traumahämatom nicht reproduzierbar dargestellt werden, bei oftmals sichtbarem Stichkanal. In den MRT- Untersuchungen, als auch in der Sonographie zeigte das Kontusionsmodell im Vergleich mit dem Punktionsmodell signifikant höhere Volumina über alle Beobachtungszeitpunkte. Photoakustisch zeigte sich in der Kontusionsgruppe posttraumatisch eine signifikant verringerte Hämoglobinkonzentration. Histologisch konnten in beiden Gruppen ebenfalls typische Merkmale der Muskelheilung beobachtet werden. An Tag 1 und 4 zeigte sich eine Invasion von Immunzellen, insbesondere Makrophagen und neutrophiler Granulozyten. Ab Tag 7 wurden in beiden Gruppen Defektzonen mit zentronukleären Zellen mit einer Hochregulation von Zellteilung und Apoptose nachgewiesen. In der Kontusionsgruppe zeigte sich in fast allen Untersuchungen signifikant höhere Zellzahlen sowie ausgeprägtere Befunde. Zusammenfassend kann das Punktionstraumamodell derzeit nicht als Alternative zum Kontusionstraumamodell für weiterführende murine Skelettmuskeltraumaforschung angesehen werden. Die gewählte Kombination der posttraumatischen Untersuchungen lässt eine gute Darstellung des Muskeltraumas und des darauffolgenden Heilungsverlaufes zu, wohingegen keines der Modelle einen beobachtbaren Einfluss auf das Gangbild zeigte.

Skeletal muscle injuries are a common clinical picture, especially in amateur or professional sports. A direct or indirect trauma results in a functional limitation of a muscle. Apart from a number of established acute measures (rest, ice, compression, elevation), there are no curative, and hardly any evidence-based symptomatic therapy options. Therefore, reliable and realistic models are needed to explore muscle healing and novel therapies. Animal models are currently best suited for multimodal investigation. In this work, a contusion model established in literature was compared with a novel puncture trauma model. To date, the puncture trauma model has not been used to study murine skeletal muscle healing. Further, the feasibility of a combination of repeated posttraumatic analyses and the effect of trauma on gait were explored. For this purpose, 24 mice were divided into 2 groups, of which 12 mice each received contusion trauma and 12 mice each received puncture trauma to the gastrocnemius muscle of the left hind leg. The resulting trauma and muscle healing were analyzed post-traumatically by functional, image morphological, and histological means. For functional analysis, gait analysis was performed by CatWalk XT 10 (Noldus, Wageningen, The Netherlands) on intervention day and days 1,4,7 and 14. Image morphology included MRI scans on intervention day and day 1,4,7 as well as sonographic examinations on intervention day and day 1,4,7,14. In addition, in-vivo photoacoustic measurements of oxygen saturation and hemoglobin content of the traumatized muscle were performed on day 1,4,7 and 14. For histological analysis, standard HE staining and immunohistochemistry were performed on days 1,4,7 and 14. Immunohistochemical analysis was performed with antibodies against CD-68, Ki-67, myeloperoxidase and caspase-3. Gait analysis showed only minor effects in both groups post-traumatically. In the contusion group, a significant reduction in imprint force was observed on day 7, but without affecting gait pattern or loading of the traumatized limb. MRI scans demonstrated trauma responses in both groups. The contusion group showed a "feather-like" hematoma analogous to that seen in humans, as well as generalized swelling of the traumatized muscle. In the puncture group, the puncture channel created by the trauma was demonstrated. Over time, the swelling of the traumatized muscle showed successive regression in the contusion group by day 7 and in the puncture group by day 4. Sonographically, swelling of the traumatized muscle was demonstrated in both groups. The intramuscular hematoma could also be partially visualized in the contusion group. In the puncture group, the trauma hematoma could not be reproducibly visualized, with often visible puncture canal. In the MRI examinations, as well as in the sonography, the contusion model showed significantly higher volumes compared to the puncture model at all observation times. Photoacoustically, the contusion group showed significantly decreased hemoglobin concentration posttraumatically. Histologically, typical features of muscle healing were also observed in both groups. On days 1 and 4, there was an invasion of immune cells, especially macrophages and neutrophilic granulocytes. From day 7, defect zones containing centronuclear cells with upregulation of cell division and apoptosis were detected in both groups. The contusion group showed significantly higher cell counts in almost all examinations, as well as more pronounced findings. In conclusion, currently the puncture trauma model cannot be considered as an alternative to the contusion trauma model for advanced murine skeletal muscle trauma research. The chosen combination of post-traumatic studies allows a good representation of the muscle trauma and the subsequent healing process, whereas none of the models showed an observable influence on the gait pattern.