The baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae as a model for studying chronic diseases related to lipid-based ER-stress

Abstract

The composition of biological membranes is a complex interplay of lipids and proteins. The lipid part is organized in the form of a lipid bilayer that allows integral uptake of membrane proteins as well as their peripheral association. Membranes allow the formation of compartments that ensure an optimized execution of biochemical processes. This optimization of metabolic processes is achieved through maintaining a membrane specific protein and lipid composition. The composition and function of biological membranes go hand in hand and are interdependent. For example, the barrier function of the plasma membrane in eukaryotic cells is based on an increased packing density of lipids, which is ensured by maintaining a sterol gradient along the secretory pathway. Since the molar fraction of lipids exceeds the fraction of membrane proteins within a membrane, they exert a significant impact on the determination of physicochemical properties. Furthermore, cellular lipid composition is more subject to external stimuli such as dietary changes and is more dynamically regulated. Thus, it is desirable to obtain a more detailed understanding of the impact lipid environments exert on the functionality of membrane proteins. Although knowledge about the diversity of membrane compositions is growing, mechanisms responsible for the adaptation and maintenance of these membrane compositions remain poorly understood. The endoplasmic reticulum (ER) is the central organelle for lipid biosynthesis in most eukaryotic cells and marks the entry point to the secretory pathway. It is therefore the ideal organelle to address questions of cellular regulation of membrane composition. The ER forms a continuous and branched membrane network that can be subdivided both structurally and functionally into specialized subdomains. The two most prominent functional subdomains are the rough ER (RER) and the smooth ER (SER). The naming of the domains is derived from the appearance of the membrane surface. In the case of the RER, the membrane surface is populated with translating ribosomes. The RER is thus a hotspot of protein biosynthesis. The SER, on the other hand, is devoid of ribosomes but harbors, among other things, enzymes responsible for de novo lipid synthesis. Thus, both subdomains of the ER functionally complement one another and enable a coordinated membrane biogenesis. Furthermore, the ER is largely responsible for the maturation of secretory proteins, which account for nearly one third of cellular protein synthesis. Subtle perturbations in the balance of protein production and protein folding can overwhelm the folding capacities of the ER and subsequently lead to an accumulation of unfolded or misfolded proteins. Such a condition is commonly referred to as ER-stress. Blockage or long-term impairment of ER functionality has far-reaching consequences and is suspected to be involved in the development of complex metabolic diseases such as diabetes mellitus and non-alcoholic fatty liver disease. The unfolded protein response (UPR) is of particular importance in combating and preventing ER-stress. The UPR is a highly conserved signaling pathway in eukaryotic cells that is thought to buffer short secretory stress peaks by dynamically regulating the secretory capacity of the ER. Since the discovery of the UPR, the canon of activating signals has continued to expand and now includes perturbed lipid composition of the ER membrane. Aberrant lipid compositions that result in the activation of the UPR are termed lipid bilayer stress (LBS).The present work is divided into three sections and each section is devoted to an overarching theme of an LBS-driven UPR. In the first section, the extent to which a functional UPR is involved in modeling cellular lipid composition in the steady state of a cultivation was investigated. Furthermore, the question was addressed to what extent the UPR is actively involved in an adaptation of lipid composition under ER stress. To address these questions, we took advantage of the fact that the UPR in S. cerevisiae is mediated by a single sensor protein, the inositol requiring enzyme 1 protein (Ire1p). Hence, by using a wild-type (WT) strain and the isogenic ire1∆ strain, it was possible to distinguish between UPR-dependent and UPR-independent processes in the remodeling of cellular lipid composition. The reducing agent dithiothreitol (DTT), which interferes with the formation of disulfide bridges in the lumen of the ER, and the pharmacologically active compound tunicamycin (TM), which inhibits N-glycosylation of newly synthesized proteins, were used as inducers of proteotoxic ER stress. The potency of both agents was systematically determined in a growth-based minimal inhibitory concentration (MIC) assay for both strains for complex rich culture medium as well as for synthetic defined minimal medium. Concentrations that reliably triggered the UPR were used in follow-up experiments and their effects on cell growth and lipid composition were analyzed. It was found that there were no significant differences between the strains in terms of cell growth. The greatest difference in growth rate was seen in the comparison between the two media in the case of the unstressed condition. When the strains were cultured in rich complex medium they showed a doubling rate of 86 min, opposed to a doubling rate of 107 min in the case of the synthetic-defined minimal medium. The selected concentrations of DTT and TM showed a growth inhibitory effect for both strains that occurred one hour after application regardless of the medium. Quantitative lipidomic analyses of the stressed and unstressed cells showed that for short-term treatment (1 h), both DTT and TM had negligible effects on the lipid composition of WT and ire1∆ cells in case of the synthetic-defined minimal medium. On the other hand, in the case of the rich and complex medium, there was a significant accumulation of phosphatidate (PA) in cells stressed with DTT compared to the unstressed control.Comparison of lipid composition showed, as in the case of growth rate, that the greatest differences occurred between the media. Here, significant changes were found in the lipid class of ergosterol, the complex sphingolipids, the phosphoglycerides phosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol, and the storage lipids triacylglycerides and ergosterol ester. The study systematically addressed the question of the extent to which DTT and TM, as agents for inducing a UPR, have an effect on the cellular lipid composition. In conclusion, the UPR does not affect lipid composition in the absence of ER stress-inducing agents. Furthermore, the data imply that the UPR induced by DTT or TM in the acute phase one hour after drug application has no significant effect on the membrane composition in synthetic-defined minimal medium under the here established conditions. In the second section, the dimerization behavior of Ire1p under proteotoxic and LBS conditions was investigated. A prerequisite for Ire1p-dependent activation of the UPR is oligomerization of individual Ire1p protomers. Crystal structure analyses of the soluble sensor domain of Ire1p have revealed interaction sites for di- and oligomerization and contributed to our understanding of an activation of Ire1p by proteotoxic stress. In addition, a mechanism for membrane-mediated oligomerization by aberrant lipid composition has been described in the past. This mechanism is based on the unusual structure of the transmembrane domain of Ire1p. It consists of a short hydrophobic transmembrane helix (TMH) which transitions into an amphipathic helix (AH) at its N-terminus. This unusual architecture causes the AH to insert into the ER membrane with the hydrophobic side, thereby inducing a tilt of the short TMH. In addition, the transmembrane domain (TMD) of Ire1p causes local compression of the membrane. The energetic cost of membrane deformation is dependent on the lipid composition, which largely correlates with the prevailing lipid packing density. Ire1p can minimize the increased energetic cost of membrane stiffening via oligomerization by minimizing the membrane area to be compressed. However, whether different forms of ER stress, i.e. proteotoxic ER stress or LBS, differentially affect the architecture of Ire1p in the TMD was unresolved. To resolve structural changes in the TMD, systematic cysteine- mediated crosslinking was performed. For this purpose, a cysteine-free variant of Ire1p was first generated and genomically integrated by homologous recombination. Genomic integration and expression by the native Ire1p promoter were used to account for the oligomerization-induced activation of Ire1p by an endogenous expression level. The functionality of this cysteine-free variant was validated at the cellular level in the form of growth assays and on the molecular level via RT-qPCR of UPR specific mRNAs. Subsequently, single cysteines were introduced into the cysteine-free construct by mutagenesis of the TMD. The single cysteine variants generated in this way were reassessed for their ability to trigger a UPR. To identify residues that potentially establish an interaction surface in signal-actingclusters of Ire1p, ER membranes were obtained from cells that were either unstressed or previously treated by DTT, TM, or by inositol depletion, as a form of pure LBS. This showed that the single cysteine mutant F544C exhibited the highest cross-linking efficiency for all stress conditions tested. Furthermore, a comparable cross-linking pattern emerged for all stress conditions, such that the TMD of Ire1p appears to adopt a single conformation upon activation regardless of the type of ER-stress applied. In the third section of the presented thesis, I utilized a mutant of the OLE signaling pathway to study the role of the UPR in context of LBS. This mutant is characterized by an increased degree of saturation of membrane lipids compared to wild-type cells. In S. cerevisiae, there is only a single gene, OLE1, which encodes a ∆-9 desaturase that inserts double bonds into acyl-CoA precursors of membrane lipids. The OLE pathway describes the regulation of OLE1 expression and is mediated by the two transcription factors Mga2p and Spt23p. Deletion of the MGA2 gene can induce a dysregulation that is responsible for an increase in the degree of saturation concomitant with an activation of the UPR. The aim was to use S. cerevisiae to create a eukaryotic model system with which the role of saturated lipids in perpetuating an ER-stress condition could be investigated. This question is relevant because a variety of complex metabolic diseases, such as diabetes mellitus or non-alcoholic fatty liver disease, have been associated with elevated levels of saturated lipids. The presented results provide clues to the molecular mechanisms that may be involved in the development of such diseases. Initially, growth conditions were optimized to maximize membrane-based stress. As a result, cell viability and cell viability were strongly reduced in the mga2∆ mutant opposed to the WT. Furthermore, the proportion of saturated membrane lipids increased to 50-mol %. The significant change in lipid composition was accompanied by dramatic, morphological changes in the ER, which occurred in up to 70% of the microscopically analyzed mga2∆ cells. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments demonstrated that the diffusion rate of ER-derived membrane proteins within the aberrant ER was significantly reduced compared with a healthy ER. To identify modulators of this morphologically aberrant ER, a genome-wide high-content screen was performed. A variety of gene deletions were identified that either decreased ("rescue") or increased ("worse") the appearance of the aberrant structures. While gene deletions from the "rescue" class showed an increased number of mutants regulating the cell cycle and specifically mitosis, the representatives of the "worse" class were predominantly of mitochondrial origin. Validation of selected representatives of both classes at the level of lipid composition and percent distribution of aberrant ER showed that, as expected, aberrant ER formation correlated with the amount of saturated glycerophospholipids. In addition, these mutants showed significantly increased levels of ceramides, phosphatidic acids, and diacylglycerides.The formation of the aberrant ER could be narrowed down to the act of mitosis by time-lapse microscopy. This process is preceded by a significant increase in membrane mass in interphase. Further supporting data indicative of cell cycle involvement in the formation of the aberrant ER structures could be collected in a secondary targeted screen. In this secondary screen, individual genes were overexpressed that had an effect on the residence time in individual cell cycle phases. The percentages of aberrant ER harboring cells exceeded the values from the original screen of the "rescue" as well as the "worse" category. It was further investigated whether UPR-induced membrane expansion could contribute to the formation of the structures. Expression of inducible membrane expansion systems, as well as overexpression of the ICE2 gene, which leads to ER membrane expansion in wild-type cells, caused a significant increase in aberrant ER structures in the mga2∆ strain background. In a third growth-based post-screening, mutants and additives affecting the growth of the mga2∆ mutant were investigated. This is interesting because it has previously been shown that mga2∆ cells exhibit a distinct growth defect compared to wild-type ones when switching from fermentative growth to respiration. Mitochondrial involvement could thus be identified by correlating the growth defect with the generation of reactive oxygen species (ROS). Overexpression of HAP4, a transcription factor that upregulates mitochondrial activities and leads to the excessive generation of ROS, caused a deterioration of cell growth only in the mga2∆ strain background. Supplementation of the medium with the free radical scavenger vitamin C significantly reduced the growth defect of mga2∆. Consequently, it was also shown microscopically that the development of an aberrant ER in mga2∆ cells was prevented by both vitamin C and reduced glutathione. Overall, a model system was established that allows an investigation of the interplay of the unfolded protein response with cell cycle regulation, lipid metabolism and mitochondrial function.

Die Komposition biologischer Membranen ist ein komplexes Zusammenspiel aus Lipiden und Proteinen. Der Lipidanteil organisiert sich in Form einer Lipiddoppelschicht die eine integrale Aufnahme von Membranproteinen erlaubt als auch deren periphere Assoziation ermöglicht. Membranen erlauben die Bildung von Kompartimenten die ein optimiertes Ablaufen von biochemischen Prozessen gewährleisten. Erreicht wird diese Optimierung von Stoffwechselprozessen, indem jede Membran eine spezifische Protein- und Lipidzusammensetzung aufweist. Die Komposition und Funktion biologischer Membranen gehen Hand in Hand und bedingen einander. So beruht die Barrierefunktion der Plasmamembran in eukaryotischen Zellen auf einer erhöhten Packungsdichte der Lipide, die durch Aufrechterhaltung eines Sterol-Gradienten entlang des sekretorischen Weges gewährleistet wird. Da der molare Anteil der Lipide den Anteil der Membranproteine innerhalb einer Membran übersteigt, kommt Ihnen eine besondere Rolle bei der Bestimmung physiochemischer Eigenschaften zu. Ferner unterliegt die zelluläre Lipidzusammensetzung stärker externen Reizen wie sie beispielsweise bei Änderungen der Diät auftreten und wird dynamischer reguliert. Demnach ist es erstrebenswert ein genaueres Verständnis über die Wirkung der Lipidumgebung auf die Funktionalität von Membranproteinen zu erhalten. Obwohl das Wissen bezüglich der Unterschiedlichkeit von Membrankompositionen stetig wächst bleiben Mechanismen, die für die Adaption und Aufrechterhaltung dieser Membrankompositionen verantwortlich sind weitestgehend unverstanden. Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist das zentrale Organell für die Lipidbiosynthese in den meisten eukaryotischen Zellen und markiert den Eintrittspunkt zum sekretorischen Weg. Es ist daher das ideale Organell, um Fragen der zellulären Regulation von Membrankompositionen zu adressieren. Das ER bildet ein kontinuierliches und verzweigtes Membrannetzwerk aus, welches sich sowohl strukturell als auch funktionell in spezialisierte Subdomänen unterteilen lässt. Die beiden prominentesten funktionellen Subdomänen sind das raue ER (englisch rough ER (RER)) und das glatte ER (englisch smooth ER (SER)). Die Namensgebung der Domänen leitet sich aus dem Erscheinungsbild der Membranoberfläche ab. Im Fall des RER ist die Membranoberfläche mit translatierenden Ribosomen bestückt. Das RER ist somit ein Hotspot der Proteinbiosynthese. Das SER hingegen ist frei von Ribosomen, beherbergt jedoch unter anderem Enzyme die für die de novo Lipidsynthese verantwortlich sind. Beide Subdomänen des ER ergänzen sich demnach funktional und ermöglichen eine koordinierte Membranbiogenese. Ferner ist das ER maßgeblich für die Reifung sekretorischer Proteine, die knapp ein Drittel der zellulären Proteinsynthese stellen, verantwortlich. Feine Störungen im Gleichgewicht von Proteinproduktion und Proteinfaltung können dieFaltungskapazitäten des ER überfordern und in Folge zu einer Akkumulation ungefalteter oder fehlgefalteter Proteine führen. Ein solcher Zustand wird allgemein als ER-Stress bezeichnet. Eine Blockierung oder langfristige Beeinträchtigung der Funktionalität des ER hat weitreichende Folgen und steht im Verdacht an der Entstehung von komplexen metabolischen Erkrankungen wie Diabetes mellitus und der nicht-alkoholischen Fettleber beteiligt zu sein. Eine besondere Bedeutung in der Bekämpfung und Vorbeugung von ER-Stress kommt der unfolded protein response (UPR) zu. Die UPR ist ein hoch-konservierter Signalweg in eukaryotischen Zellen, der kurze sekretorische Belastungsspitzen abfangen soll indem er dynamisch die sekretorische Kapazität des ER reguliert. Seit der Entdeckung der UPR hat sich der Kanon der aktivierenden Signale stets erweitert und beinhaltet inzwischen auch eine gestörte Lipidzusammensetzung der ER-Membran. Aberrante Lipidzusammensetzung, die eine Aktivierung der UPR zur Folge haben, werden als lipid bilayer stress (LBS) bezeichnet. Die vorliegende Arbeit ist in drei Abschnitte unterteilt und jeder Abschnitt ist einem übergreifenden Thema einer LBS getriebenen UPR gewidmet. Im ersten Abschnitt wurde untersucht, inwiefern eine funktionale UPR an der Modellierung der zellulären Lipidkomposition im steady state einer Kultivierung beteiligt ist. Ferner wurde die Frage bearbeitet inwieweit die UPR aktiv an einer Adaption der Lipidzusammensetzung bei ER-Stress beteiligt ist. Um diesen Fragen gerecht zu werden, wurde sich die Tatsache zu Nutze gemacht, dass die UPR in S. cerevisiae von einem einzigen Sensorprotein, dem inositol requiring enzyme 1 protein (Ire1p) vermittelt wird. Demnach konnte durch Verwendung eines Wildtyp-Stammes (WT) und dem isogenen ire1∆ Stamm zwischen UPR-abhängigen und UPR-unabhängigen Vorgängen bei der Remodellierung der zellulären Lipidkomposition unterschieden werden. Als Auslöser eines proteotoxischen ER-Stress wurde das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT), welches unter anderem mit der Ausbildung von Disulfidbrücken im Lumen des ER interferiert, sowie der Wirkstoff Tunicamycin (TM), der die N-Glykosylierung von neu synthetisierten Proteinen unterbindet, verwendet. Die Potenz beider Wirkstoffe wurde systematisch in einem wachstumsbasierten minimal inhibitory concentration (MIC) Assay für beide Stämme für komplexes reichhaltiges Nährmedium als auch für synthetisch definiertes Nährmedium bestimmt. Konzentrationen die zuverlässig die UPR auslösten wurden in Folgeexperimenten eingesetzt und deren Wirkung auf Zellwachstum und Lipidkomposition analysiert. Dabei zeigte sich im Hinblick auf das Zellwachstum, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Stämmen gab. Der größte Unterschied in der Wachstumsrate zeigte sich im Vergleich zwischen beiden Medien im Fall der ungestressten Bedingung. Wurden die Stämme in reichem, komplexem Medium kultiviert zeigten sie eine Verdopplungsrate von 86 min, im Fall des synthetisch-definiertem Medium eine Verdopplungsrate von 107 min. Die gewählten Konzentrationen von DTT und TM zeigten für beide Stämme einen wachstumshemmenden Effekt der eine Stunde nach Applikation unabhängig vom Medium eintrat. Quantitative Lipidomanalysen der gestressten und ungestressten Zellen zeigten, dass bei kurzzeitiger Behandlung (1 Stunde) sowohl DTT als auch TM in Fall des synthetisch-definiertem Medium nur einen vernachlässigbaren Effekt auf die Lipidkomposition von WT und ire1∆ Zellen hatten. Im Fall des reichen und komplexen Mediums hingegen, kam es in mit DTT gestressten Zellen zu einer signifikanten Akkumulation von Phosphatidat (PA) gegenüber der ungestressten Kontrolle. Der Vergleich der Lipidkomposition zeigte wie schon im Fall der Wachstumsrate, dass die größten Unterschiede zwischen den Medien auftraten. Hier wurden signifikante Änderungen in der Lipidklasse von Ergosterol, den komplexen Sphingolipiden, den Phosphoglyceriden Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol sowie den Speicherlipiden Triacylglyceriden und dem Ergosterolester festgestellt. Die Studie hat systematisch die Frage adressiert inwiefern DTT und TM als Wirkstoffe zur Induktion einer UPR einen Einfluss auf die Lipidkomposition nehmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die UPR keinen Einfluss auf die Lipidkomposition in Abwesenheit von ER Stress induzierenden Wirkstoffen nimmt. Ferner zeigte sich, dass die UPR ausgelöst durch DTT oder TM in der akuten Phase eine Stunde nach Initiation der Signalkaskade keinen signifikanten Einfluss auf die Membrankomposition in synthetisch-definiertem Medium unter den hier etablierten Bedingungen nimmt. Im zweiten Abschnitt lag der Fokus auf dem Dimerisierungsverhalten von Ire1p. Voraussetzung für die Ire1p abhängige Aktivierung der UPR ist die Oligomerisierung einzelner Ire1p Protomere. Kristallstrukturanalysen der löslichen Sensordomäne von Ire1p haben Interaktionsflächen für die Di- und Oligomerisierung offenbart und zu unserem Verständnis einer Aktivierung von Ire1p durch proteotoxischen Stress beigetragen. Zudem konnte in der Vergangenheit ein Mechanismus für eine Membran vermittelte Oligomerisierung durch aberrante Lipidzusammensetzung beschrieben. Dieser Mechanismus beruht auf dem ungewöhnlichen Aufbau der Transmembrandomäne von Ire1p. Sie besteht aus einer kurzen hydrophoben Transmembranhelix (TMH) welche an Ihrem N-Terminus in eine amphipathische Helix (AH) übergeht. Diese ungewöhnliche Architektur bewirkt, dass die AH mit der hydrophoben Seite in die ER-Membran inseriert und dadurch eine Neigung der kurzen TMH veranlasst. Zusätzlich führt die Transmembrandomäne (TMD) von Ire1p zu einer lokalen Kompression der Membran. Die energetischen Kosten für die Deformierung der Membran ist abhängig von der Lipidzusammensetzung, die größtenteils mit der vorherrschenden Lipidpackungsdichte korreliert. Ire1p kann die erhöhten energetischen Kosten einer Membranversteifung durch eine Oligomerisierung minimieren, indem es die zu komprimierende Membranfläche minimiert.Ob allerdings unterschiedliche Formen von ER-Stress, also proteotoxischer ER-Stress oder LBS, die Architektur von Ire1p in der TMD unterschiedlich beeinflussen war ungeklärt. Um strukturelle Änderungen im Bereich der TMD aufzulösen, wurde ein systematisches Cystein- vermitteltes Crosslinking durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine Cystein-freie Variante von Ire1p generiert und mittels homologer Rekombination genomisch integriert. Die genomische Integration und Expression durch den nativen Ire1p Promotor diente dazu der Oligomerisierung-bedingten Aktivierung von Ire1p durch ein endogenes Expressionslevel Rechnung zu tragen. Die Funktionalität dieser Cystein-freien Variante wurde auf zellulärer Ebene in Form von Wachstumsassays und molekularer Ebene via RT-qPCR von UPR spezifischen mRNAs validiert. Anschließend wurden einzelne Cysteine durch Mutagenese der TMD in das Cystein-freie Konstrukt eingebracht. Die so generierten Einzelcysteinvarianten wurden erneut auf Ihre Fähigkeit hin untersucht eine UPR auszulösen. Um Reste zu identifizieren, die in Signal-aktiven Clustern von Ire1p potentiell eine Interaktionsfläche herstellen, wurden ER-Membranen aus Zellen gewonnen die entweder ungestresst waren oder zuvor mittels DTT, TM oder durch Inositol-Depletion, als Form eines reinen LBS, behandelt wurden. Dabei zeigte sich, dass die Einzelcysteinmutante F544C die höchste Quervernetzungseffizienz für alle getesteten Stressbedingungen aufwies. Ferner zeichnete sich ein vergleichbares Quervernetzungsmuster für alle Stressbedingungen ab, sodass die TMD von Ire1p scheinbar unabhängig von der Art des angewandten ER-Stresses bei Aktivierung eine einzige eine einzige Konformation einnimmt. Im dritten Abschnitt der vorliegenden Arbeit habe ich mich dem Wissen um eine Mutante des OLE-Signalwegs bedient. Diese Mutante zeichnet sich durch einen erhöhten Sättigungsgrad von Membranlipiden im Vergleich zu wildtypischen Zellen aus. In S. cerevisiae existiert lediglich ein einziges Gen, OLE1, welches für eine ∆-9-Desaturase kodiert, die Doppelbindungen in Azyl-CoA Vorläufer von Membranlipiden einfügt. Der OLE-Signalweg beschreibt die Regulation der Expression von OLE1 und wird durch die beiden Transkriptionsfaktoren Mga2p und Spt23p vermittelt. Durch Deletion des MGA2 Gens kann eine Fehlregulation herbeigeführt werden, die neben dem Anstieg des Sättigungsgrades auch eine Aktivierung der UPR verantwortet. Ziel war es, mit S. cerevisiae ein Modelsystem zu schaffen mit dem die Rolle gesättigter Lipide bei der chronischen Aktivierung der UPR untersucht werden kann. Diese Fragestellung ist relevant, weil eine Vielzahl komplexer, metabolischer Krankheitsbilder wie z.B. ein Diabetes mellitus oder die nicht-alkoholische Fettleber in Verbindung mit erhöhten Mengen an saturierten Lipiden gebracht wurden. Die vorliegenden Ergebnisse geben Hinweise auf die molekularen Mechanismen die bei der Entstehung solcher Erkrankungen involviert sein könnten. Zunächst wurden die Wachstumsbedingungen dahingehend optimiert, dass sich der Membran-basierte Stressmaximal ausprägt. Dieser Zeitpunkt war gekennzeichnet durch eine stark verminderte Zellvitalität und Zellviabilität. Ferner stieg der Anteil der gesättigten Membranlipide auf 50-mol % an. Die signifikante Veränderung der Lipidzusammensetzung ging mit dramatischen, morphologischen Veränderungen des ER einher, die in bis zu 70 % der mikroskopisch analysierten Zellen auftraten. Mit fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Diffusionsgeschwindigkeit von ER-ständigen Membranproteinen innerhalb des aberranten ER gegenüber einem gesunden ER signifikant verringert war. Um Modulatoren dieses morphologisch, aberranten ER zu identifizieren, wurde ein Genom-weiter high-content Screen durchgeführt. Es wurde eine Vielzahl von Gendeletionen identifiziert, die das Auftreten der aberranten Strukturen entweder verringern („rescue“) oder verstärken („worse“). Während Gendeletionen aus der „rescue“ Klasse vermehrt Mutanten aufwiesen, die den Zellzyklus und speziell die Mitose regulieren, so waren die Vertreter der „worse“ Klasse überwiegend mitochondrialen Ursprungs. Die Validierung ausgewählter Vertreter beider Klassen auf Ebene der Lipidzusammensetzung und der prozentualen Verteilung des aberranten ER zeigte, dass die Ausbildung des aberranten ER erwartungsgemäß mit der Menge der gesättigten Glycerophospholipide korreliert. Außerdem zeigten diese Mutanten ein signifikant erhöhtes Level an Ceramiden, Phosphatidsäuren und Diacylglyceriden. Die Formation des aberranten ER konnte mittels Zeitraffer-Mikroskopie auf den Vorgang der Mitose eingegrenzt werden. Diesem Prozess ist eine signifikante Zunahme der Membranmasse in der Interphase vorgeschaltet. Weitere unterstützende Daten, die für eine Beteiligung des Zellzyklus an der Entstehung der Strukturen sprechen, konnten in einem sekundären, gezielten Screen erhoben werden. In diesem sekundären Screen wurden einzelne Gene überexprimiert, die einen Einfluss auf die Verweildauer in einzelnen Zellzyklusphasen haben. Die prozentualen Anteile des aberranten ER-Phänotyps übertrafen die Werte aus dem ursprünglichen Screen der „rescue“ als auch der „worse“ Klasse. Es wurde weiter untersucht, ob eine UPR-bedingte Membranexpansion einen Beitrag zu der Entstehung der Strukturen leisten könnte. Die Expression von induzierbaren Membranexpansionselementen, als auch die Überexpression des ICE2 Gens, welches zu einer ER-Membranexpansion in wildtypischen Zellen führt, sorgte im mga2∆ Stammhintergrund zu einer signifikanten Zunahme der aberranten ER-Strukturen. In einem dritten Wachstums-basierten Nachscreening wurden Mutanten und Additive untersucht, die das Wachstum der mga2∆ Mutante beeinflussen. Dies ist interessant, weil zuvor gezeigt wurde, dass mga2∆ Zellen gegenüber wildtypischen beim Wechsel vom fermentativen Wachstum zur Respiration einen deutlichen Wachstumsdefekt aufweisen. Eine Beteiligung der Mitochondrien konnte somit durch Korrelation des Wachstumsdefekts mit der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (englisch reactive oxygen species (ROS)) identifiziert werden. Die Überexpression von HAP4, einem Transkriptionsfaktor, der mitochondriale Aktivitäten hochreguliert und zur übermäßigen Bildung von ROS führt, sorgte lediglich im mga2∆ Stammhintergrund für eine Verschlechterung des Zellwachstums. Durch Supplementation des Mediums mit dem Radikalfänger Vitamin C konnte der Wachstumsdefekt von mga2∆ deutlich verringert werden. Folgerichtig konnte auch mikroskopisch gezeigt werden, dass die Entstehung eines aberranten ER in mga2∆ Zellen sowohl durch Vitamin C als auch reduziertes Glutathion verhindert wird. Insgesamt wurde ein Modellsystem etabliert, das eine Untersuchung des Zusammenspiels der unfolded protein response mit der Zellzyklusregulierung, dem Lipidstoffwechsel und der mitochondrialen Funktion ermöglicht.