Rolle des Na+-aktivierten Kaliumkanals Slack für Hörvermögen, Hörnervsynapsen und die Vulnerabilität gegenüber Schalltrauma bei der Maus DISSERTATION

Abstract

Der Slack-Kanal, ein Natrium- und spannungsaktivierter Kaliumkanal, führt neben anderen Kaliumkanälen zur Repolarisation eines Neurons in Folge neuronaler Erregung. Gerade bei starker Erregung ist diese Art der Regulation wichtig, um Erregungstoxizität in den Zellen zu vermeiden. Fehlfunktionen des Slack-Proteins steht mit einer Reihe von Epilepsien in Verbindung. Obwohl in Spiralganglienneuronen (SGN) der Cochlea nachgewiesen, ist die Lokalisation und physiologische Rolle des Kanals für die Hörfunktion unbekannt. Beim Hören sind schnell feuernde und hochpräzise regulierte Neuronen von Bedeutung, weshalb eine Deletion von Slack in der Maus auditorische Konsequenzen haben könnte. Die Fragestellung dieser Arbeit war daher die Rolle des Na+-aktivierten Kaliumkanals Slack für Hörvermögen, Synapsen zwischen inneren Haarzellen (IHZ) und SGN und die Vulnerabilität gegenüber Schalltrauma bei der Maus. Mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie sollte die zelluläre Expression des Kaliumkanals auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht werden. Das Hörvermögen wurde durch auditorische Hirnstamm (ABR) -Messungen auf Klick- und frequenzspezifische Reize untersucht, die Hörschwellen sowie Amplituden und Latenzen der ABR-Welle I lieferten, welche die Aktivität des Nervus cochlearis widerspiegeln. Das Phänomen der cochleären Synaptopathie wurde durch Analyse von CtBP2-markierten Prä- und Homer1-markierten Postsynapsen untersucht. Da die Proteinlokalisation von Slack im Corti-Organ mit Hilfe von Antikörpern nicht erfolgreich war, wurde die Methode des RNAScope®-Nachweises in Gefrierschnitten der Cochlea etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte jedoch noch keine abschließende Lokalisation von Slack in den Spiralganglien der Cochlea erzielt werden. Slack-defiziente Mäuse unterschieden sich in Bezug auf die Hörschwellen im Alter von 8 Wochen nicht von ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern. Zwei unterschiedlich starke Schalltraumata (100 bzw. 106 dB SPL, 8-16 kHz, 2 h) bewirkten bei beiden Genotypen sehr ähnliche direkte Erhöhungen der frequenzspezifischen Hörschwellen, die mit der Trauma- Stärke zunahmen. Vier Wochen nach dem 106 dB SPL Schalltrauma zeigten Slack-defiziente Tiere paradoxerweise eine bessere Regeneration der Schwellen als die Wildtyp-Tiere. Verminderte Amplituden der ABR-Welle I und erhöhte Latenzen von 11,3 - 32 kHz bei beiden Genotypen zeigen die Beeinträchtigung funktionaler synaptischer Verbindungen nach Trauma. Eine Zuordnung betroffener Präsynapsen-SGN-Subtyp-Verbindungen anhand von Veränderungen der Amplituden und Latenzen der ABR-Welle I erschien jedoch nicht möglich. In Bezug auf die hörphysiologischen Parameter bestätigte sich die vermutete erhöhte Vulnerabilität der Slack-defizienten Tiere gegenüber Schalltrauma nicht. 12 Wochen alte Slack-defiziente Tiere ohne Traumaexposition wiesen gegenüber Wildtyp- Tieren einen spezifischen Phänotyp mit einer um 2-3 reduzierten Anzahl von Postsynapsen pro IHZ im apikalen, medialen und midbasalen Cochleabereich auf. Vier Wochen nach Trauma wurde im mittel- bis hochfrequenten Bereich eine deutliche Reduktion der Anzahl der Präsynapsen/IHZ festgestellt, die bei beiden Genotypen verglichen mit den Postsynapsen die vulnerableren Strukturen waren. Im Vergleich zum Wildtyp zeigten Slack-defiziente Tiere nur im hochfrequenten Bereich mit einem Verlust der Ribbons auf 41 % und der Postsynapsen auf 60 % eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber dem 106 dB SPL Trauma. Claudine sind für die Dichtigkeit von Epithelien essenzielle tight junction-Proteine, die an der Kompartimentierung von Endo- und Perilymphe in der Cochlea beteiligt sind. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts des Graduiertenkollegs IRTG1830 bei Prof. Dr. Todd Alexander an der Universität von Alberta in Edmonton wurde eine Claudin12-defiziente Maus mit LacZReportersystem untersucht. Nach Etablierung eines Protokolls für die Expression von ß- Galactosidase in der Cochlea wurde eine Claudin12-Reporter-Expression von LacZ in den IHZ nachgewiesen. Nach Import des Mausmodells nach Homburg wurden histologische Untersuchungen und Hörmessungen an Claudin12-defizienten Mäusen im FVB/N-Hintergrund durchgeführt. Corti-Präparate von Claudin12-defizienten Mäusen wiesen Lücken in den Reihen der äußeren Haarzellen auf. Diese existierten auch in FVB/N-Wildtyp-Tieren, jedoch waren Claudin12- defiziente Mäuse von der Degeneration in jüngeren Altersstufen stärker betroffen als Wildtypen. Der Phänotyp entwickelte sich stärker in der apikalen als in der basalen Hälfte der Cochlea. Genetische Deletion von Claudin12 bewirkte keinen auditorischen Phänotyp, da Claudin12- defiziente Mäuse ähnliche frequenzabhängige Hörschwellen wie die FVB/N-Wildtypen im Alter von 8 Wochen aufwiesen. Die Untersuchung älterer Tiere oder eine Exposition gegenüber einem Schalltrauma könnte künftig zur Aufklärung der Funktion von Claudin12 in der Cochlea beitragen.

The Slack channel, a sodium- and voltage-activated potassium channel is besides other potassium channels responsible for neuronal repolarization. To avoid excitotoxicity, this type of regulation is particularly important after strong excitation. Malfunction of Slack protein is associated with different forms of epilepsy. Even though Slack mRNA is expressed in spiral ganglion neurons (SGN) of the cochlea its localization and physiological impact on hearing is unknown so far. Because fast and precisely spiking neurons are essential in hearing deletion of Slack could result in severe consequences in auditory processing. The aim of this thesis was to determine the role of the sodium-activated potassium channel Slack for hearing function, synapses between inner hair cells (IHC) and SGN, and the vulnerability to acoustic trauma in mice. The cellular expression of Slack was studied using high resolution fluorescence microscopy on protein and mRNA level. Hearing was examined by auditory brainstem response (ABR) measurements in response to click- and frequency specific stimuli. They yielded amplitudes and latencies of ABR wave I reflecting the activity of the cochlear nerve. The phenomenon of cochlear synaptopathy was studied by analyzing by pre- and postsynapses labeled with CtBP2 and Homer1, respectively. Since protein localization by anti-Slack antibodies was not successful in whole mount organ of Corti preparations, the method of RNAScope® was established in cryosections of the cochlea. However, a final localization of Slack mRNA in spiral ganglion neuron subtypes of the cochlea was not achieved within this thesis. Slack-deficient mice aged 8 weeks showed similar hearing thresholds as their littermates. Two acoustic traumata of different strength (100 resp. 106 dB SPL, 8-16 kHz, 2 h) lead to similar frequency-specific threshold elevations in both genotypes, which increased with trauma strength. Four weeks after the 106 dB SPL trauma, Slack-deficient mice paradoxically showed better regeneration of thresholds compared to wildtypes. Reduced amplitudes and increased latencies of ABR-wave I between 11,3 - 32 kHz in both genotypes indicated a loss of functional synapses after trauma. A classification of affected SGN subtype connections based on changes in amplitudes and latencies of ABR-wave I was however not feasible. Regarding the hearing parameters, the assumption of an increased vulnerability of Slack-deficient mice to acoustic trauma was not confirmed. In comparison with wildtype animals, Slack-deficient animals aged 12 weeks without noise trauma showed a specific reduction of 2-3 postsynapses per IHC in the apical, medial and midbasal turn of the cochlea. Both traumata resulted in a severe reduction of the presynapses per IHC in the middle to high frequency region in both genotypes. These synaptic ribbons were more vulnerable compared with postsynapses in both genotypes. In response to the 106 dB SPL trauma, Slack-deficient mice showed a higher loss of ribbons (to 41% of wildtype) and postsynaptic clusters (to 60% of wildtype) exclusively in the high-frequency region. Claudins are tight junction proteins and essential in forming epithelial barriers, which are involved in the compartmentalization of endolymph and perilymph of the cochlea. During a research stay organized by the International Research and Training Group IRTG1830 at the University of Alberta, Edmonton, claudin12-deficient mice with a lacZ reporter system were analyzed in the laboratory of Prof. Dr. Todd Alexander. After establishing a protocol for expression of ß-galactosidase in the cochlea, Claudin12-reporter expression of lacZ in the inner hair cells was identified. Histological studies and hearing measurements of Claudin12-deficient mice on FVB/N background were performed back in Homburg. Organ of Corti preparations of Claudin12-deficient mice showed missing outer hair cells. Although outer hair cell gaps also were found in the FVB/N wildtype, the younger Claudin12- deficient mice were affected more severely by this degeneration. Further, this phenotype progressed from the apical to the basal region. Genetic deletion of Claudin12 did not cause an auditory phenotype, as Claudin12-deficient and FVB/N wildtype mice showed similar frequency-specific hearing thresholds. Future experiments using older animals or exposing them to a noise trauma may unravel the function of claudin12 in the cochlea.