Untersuchung zur Ausprägung der Latrophiline in der Lunge unter besonderer Berücksichtigung des Asthmakandidatengens Lphn3

Abstract

Das Asthma bronchiale ist mit einer Prävalenz von ca. 300 Millionen Menschen und steigenden Inzidenz eines der häufigsten chronischen Erkrankung des Menschen und wird zum Formkreis der obstruktiven Atemwegsstörungen gezählt [20], [35], [42]. Asthma bronchiale ist definiert als eine chronisch entzündliche Atemwegserkrankung, die mit einer reversiblen Atemwegsverengung und Hyperreagibilität des Bronchialsystems einhergeht [20]. Des Weiteren ist diese Erkrankung durch eine Kontraktion der glatten Atemwegsmuskulatur, ödematöse Schleimhautschwellung und vermehrte zähflüssige Schleimproduktion gekennzeichnet [35], [42]. Die bisherige Therapie ist vorwiegend auf Signalwege von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren oder deren Liganden-Interaktionen ausgerichtet [9]. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden durch ihre Beeinflussung der Zellphysiologie als Schnittstelle zwischen physiologischen und pathologischen Zuständen angesehen [29] und stellen somit im Allgemeinen eines der wichtigsten pharmakologischen Ziele dar [14], [17]. In Veröffentlichungen von Faiz et al. (2017) [11] und Liu et al.(2018) [31] wurde eine neue Rolle der Latrophiline, besonders der Isoform Lphn3 vorgeschlagen, die u.a. durch Regulation der glatten Atemwegsmuskulatur mit pathophysiologischen Mechanismen des Asthma bronchiale in Zusammenhang gebracht werden. Latrophiline gehören zu den Adhäsions- G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die in Zusammenhang mit dem Neurotoxin α-Latrotoxin entdeckt wurden [34]. Bereits in zahlreichen Vorarbeiten sind viele v.a. neurozentrische physiologische Funktionen der Latrophiline beschrieben, die durch ihre noch nicht vollständig verstandenen Signaltransduktionsmechanismen und Adhäsionsfunktionen u.a. die Ausbildung neuronaler Netzwerke durch Synapsenbildung und Aufrechterhaltung der Synapsenfunktion fördern [17], [34], [36], [56]. Des Weiteren können sie die Verarbeitung und Modulierung der mechanischen Reizwahrnehmung regulieren und somit eine bedeutende Rolle in der Mechanosensorik einnehmen [43], [44]. Zudem besteht eine weit verbreitete Ausprägung der Latrophiline auch in extraneuronalen Geweben [17], [34]. So konnten bisher dysregulierte und fehlende Lphn-Isoformen mit verschiedenen malignen Erkrankungen [34], Erkrankungen des Stoffwechsels wie z.B. Diabetes mellitus [51] als auch zahlreichen neuropsychologischen Erkrankungen wie ADHS [34], [36], [49], Autismus Spektrum- und Substanzgebrauchsstörungen [36] in Verbindung gebracht werden. Auf Grund der Arbeiten von Faiz et al. und Liu et al. besteht ein allgemeines Interesse daran, den Zusammenhang zwischen Lphn3, seiner Expression und Lokalisation in der Lunge genauer aufzuzeigen sowie auch die Auswirkungen von dysregulierten oder fehlenden Lphns zu beschreiben. Um diesen Zusammenhang genauer untersuchen zu können, werden in dieser Arbeit genetisch modifizierte Tiere des Stamms M. musculus verwendet, so wie sie in Arbeiten von Sando et al. (2019) [41] und Anderson et al. (2017) [1] zuvor beschrieben sind. Auf Grund dieser Genmodifikationen können mittels Cre-vermittelter Rekombination somit Lphn Knock-In oder Knock-Out Tiere generiert werden, bei denen die Anwesenheit bzw. Abwesenheit des Lphn-Proteins durch das Einfügen von spezifischen Markerproteinen detektierbar werden kann. Ziel dieser Arbeit ist es anhand der hier etablierten Experimentmodifikationen somit, ein besseres Verständnis über das Latrophilin Expressionsverhältnis und die Lokalisation in der Lunge zu erlangen. Zunächst wurde mittels in dieser Arbeit etablierter PCR-Verfahren die DNA nachgewiesen, um eine richtige Probenauswahl für die Verwendung der Gewebe eines Lphn3 Knock-In oder Knock-Out Tieres in den hier durchgeführten Versuchen sicher zu stellen. Anschließend gelang der mRNA- und Proteinnachweis in der Lunge und konnte durch eine vorherige Präparation der Lunge in verschiedene Abschnitte genauer differenziert werden. So werden hier in einem Lphn3 Knock-In Tier die Transkriptmengen der verschiedenen Latrophilin-Isoformen in den verschiedenen Abschnitten nachgewiesen und im Vergleich zueinander dargestellt. Hier zeigte sich auffälliger Weise eine signifikante Verminderung der Lphn2 und Lphn3 Transkriptmenge in der Trachea. Im anschließenden Western Blot konnte die Ausprägung des Lphn3 Proteins in den präparierten Lungenabschnitten nachgewiesen werden, in der Trachea wird dieses jedoch nicht nachgewiesen. Ebenso erfolgte eine Etablierung des immunhistochemischen Nachweises des Lphn3 Proteins in der Lunge. Hier zeigten sich immunhistochemische Signale im Bereich der Bronchien, Bronchioli und Alveolen. Der anschließende Versuch, Lphn3 mittels Immunfluoreszenz nachzuweisen, gelang hier allerdings nicht. Es zeigten sich für Lphn3 lediglich unspezifische Signale, die einen ausschließlichen Nachweis in der glatten Muskulatur der Atemwege nicht möglich machten. Für Lphn2 sind hier jedoch spezifische Signale im Bereich der Basalmembran detektiert worden. Eine überraschende Erkenntnis in dieser Arbeit liefern die im Lphn3 Knock-Out Tier detektierten Lphn-Transkriptmengen. Es zeigt sich keine kompensatorische Heraufregulierung der Lphn1 und Lphn2 Transkriptmengen im Vergleich zu denen in einem Wildtyp-Tier. Die Lphn3 Transkriptmenge ist hier signifikant um 50% vermindert, welches die Frage über mögliche alternative Spleißvarianten des Lphn3 Proteins aufwirft, die in Abwesenheit des Startexons zusätzlich möglich sind. Diese Arbeit kann zusammenfassend potenziell einen Teil zum besseren Verständnis der Latrophiline, seiner Expressionsverhältnisse und seiner Lokalisation in der Lunge, mit Hauptaugenmerk auf Lphn3, beitragen. Jedoch bleiben Fragen über die genaue Lokalisation, physiologische Funktion und pathophysiologischen Zusammenhänge der Latrophiline in der Lunge offen, die es bedarf, im Rahmen von zukünftigen Forschungen, wie sie u.a. in dieser Arbeit diskutiert werden, zu klären. Zusammenfassend besitzen Latrophiline jedoch Potential, als ein vielversprechendes pharmakologisches Ziel für zukünftige molekulare Therapien des Asthma bronchiale angesehen zu werden.

With a prevalence of about 300 million people and an increasing incidence, bronchial asthma is one of the most common chronic diseases in humans and is recognized as a form of obstructive respiratory disorders [20], [35], [42]. Bronchial asthma is defined as a chronic inflammatory respiratory disease associated with reversible airway narrowing and hyperresponsiveness of the bronchial system [20]. Furthermore, this disease is char acterized by a contraction of the smooth airway muscles, edematous mucosal swelling and increased viscous mucus production [35], [42]. Current therapeutic strategies are mainly focusing on signaling pathways involving G protein-coupled receptors or interactions with their ligands [9]. G protein-coupled receptors are regarded as an interface between physiological and pathological conditions due to their influence on cell physiology [29] and thus generally represent one of the most important pharmacological targets [14], [17]. Publications by Faiz et al. (2017) [11] and Liu et al. (2018) [31] have proposed a new role of latrophilins, especially the isoform Lphn3, which is associated with the regulation of smooth airway muscle cells and pathophysiological mechanisms of bronchial asthma. Latrophilins are classified as adhesion G protein-coupled receptors that have been dis covered in connection with the neurotoxin α-latrotoxin [34]. Many neurocentric physiological functions of latrophilins have already been described in numerous preliminary studies. However, their signal transduction mechanisms and adhesion functions are not fully understood yet. Probably, they promote the formation of neuronal networks through synapse formation and maintenance of synapse function [17], [34], [36], [56]. Furthermore, they can regulate the processing and modulation of mechanical stimulus perception and can thus play an important role in mechanosensors [43], [44]. In addition, a widespread expression of latrophilins also exists in extraneuronal tissues [17], [34]. So far, dysregulated and missing latrophilin isoforms have been associated with various malignant diseases [34], metabolic diseases, e.g., diabetes [51] as well as numerous neurodevelopmental diseases such as ADHD [34], [36], [49], and autism spectrum disorders or substance use disorders [36]. Based on the work of Faiz et al. and Liu et al., there is a general interest in determining the relationship between Lphn3, its expression and localization in the lungs, and also the effects of dysregulated or missing latrophilins. To investigate this relationship in more detail, genetically modified mice have been used in this work, as previously described by Sando et al (2019) [41] and Anderson et al. (2017) [1]. Based on these gene modifications, Cre-mediated recombination can be used to generate latrophilin knock-in or knock-out animals in which the presence or absence of the respective latrophilin protein can be detected due to the insertion of specific marker proteins. The aim of this work is to gain a better understanding of the latrophilin expression ratio and their localization in lung tissue on the basis of the experimental procedures established in this thesis. First, the DNA was detected by means of PCR methods established during the course of this work in order to ensure a correct sample selection for the use of the tissues of an Lphn3 knock-in or knock-out animal in the experiments carried out. Subsequently, the mRNA and protein detection in the lungs was successful and could be further narrowed down by a preceding dissection of the lungs into different sections. Thus, in an Lphn3 knock-in animal, the transcript amounts of the different latrophilin isoforms in the different sections are detected and compared to each other. Here, a significant reduction in the amount of Lphn2 and Lphn3 transcripts in the trachea was clearly demonstrated. In the subsequent Western Blot, the Lphn3 protein was detected in different lung regions, but not in the trachea. For Lphn2, however, specific signals were detected in the area of the basal membrane. The immunohistochemical detection of the Lphn3 protein in the lungs was also established, e.g., immunohistochemical signals were detected in the bronchi, bronchioli and alveoli. However, the subsequent attempt to detect Lphn3 in immunofluorescence was not successful. For Lphn3, only non-specific signals were evident, which made it impossible to detect it exclusively in the smooth muscles of the respiratory tract, as is suspected. A significant insight in this work is provided by the latrophilin transcript sets detected in the Lphn3 knock-out animal. There is no compensatory upregulation of the amount of Lphn1 and Lphn2 transcripts compared to those in wild-type mice. The Lphn3 mRNA levels, however, were significantly reduced by 50%, which raises the question of possible alternative splice variants leading to truncated Lphn3 proteins. In summary, this work can potentially contribute to a better understanding of Lphn proteins, their expression ratios and their localization in the lungs, with a focus on Lphn3. However, questions remain about the exact localization, physiological function and path ophysiological relationships of latrophilins in the lungs, which need to be clarified in the context of potential future research, such as those discussed in this work. In conclusion, latrophilins display a great potential as promising pharmacological targets for future molecular therapies of bronchial asthma.