Klonierung und funktionelle Charakterisierung von TRPC1, 4 und 5 Proteinen mit einer Punktmutation eines hochkonservierten Glyzinrestes im S4-S5 Linker

Abstract

Die nicht selektiven Kationenkanäle Transient Rezeptor Potential Canonical (TRPC) 4 und 5 (TRPC4, TRPC5) sind nah miteinander verwandt und in ihrer Aminosäuresequenz zu 65% identisch. Aktiviert werden die Kanäle über die Phosphoinositol-Kaskade. In der vorliegenden Arbeit wurde ein evolutionär konservierter Glycinrest im zytosolischen S4-S5 Linker von den Proteinen durch polare Aminosäuren ersetzt. Diese Mutation zwingt die Kanäle in eine konstitutiv offene Konformation. Die Expression der TRPC4G503S und TRPC5G504S Proteine in HEK293 Zellen bewirkt eine Apoptose, diese konnte durch Reduktion des extrazellulären Ca2+ (Zugabe Kalziumchelator EGTA ins Medium) inhibiert werden. In fluoreszenz-basierten zytosolischen Ca2+ Messungen konnte nach Expression der Mutanten ein vermehrter Kalziumeinstrom gemessen werden. Vermutlich wird die Apoptose der Zellen durch eine Überladung mit Ca2+ Ionen ausgelöst. Der Zelltod konnte mit durchflusszytometrischen Apoptoseessays bestätigt werden und mit den unspezifischen TRP Kanalblockern SKF96365 und dreiwertigen Lanthan-Ionen reduziert werden. Im Gegensatz führt die Expression der TRPC1G506S Mutante nicht zu einem erhöhten Kalziumeinstrom und die TRPC1G506S-exprimierende Zellen werden nicht apoptotisch. Ein Homologiemodell, basierend auf der bekannten Struktur des spannungsabhängigen Kaliumkanals Kv1.2, zeigt als möglichen Interaktionspartner für die polaren Aminosäuren einen konservierten Serinrest in der C-terminalen S6 Helix des TRPC4 Proteins. Tatsächlich führt eine zweite Mutation S623A in der TRPC4G503S Mutante in Patch Clamp Experimenten (Andreas Beck) wieder zu einer geringeren Kanalaktivität. Offensichtlich kann die Mutation S623A den Effekt der Mutation G503S in TRPC4 zumindest teilweise kompensieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass der S4/S5 Linker kritisch für das Gating von TRPC4/5 Kanälen ist und dass eine Änderung seiner Sequenz zu einer Kanalöffnung unabhängig von anderen Faktoren führen kann.

The nonselective cation channels Transient Receptor Potential Canonical (TRPC) 4 and 5 (TRPC4, TRPC5) are closely related and share 65% amino acid sequence identity. They are activated by stimulation of receptors coupled to the phosphoinositide cascade. In this work we replaced a conserved glycine residue within the cytosolic S4-S5 linker of the aforementioned proteins by polar residues. This mutation forces the TRPC4 and TRPC5 channels into an open conformation. The expression of TRPC4G503S and TRPC5G504S mutants in HEK293 cells causes apoptosis, which could be prevented by reducing the extracellular Ca2+ concentration of the culture medium. Fluorescence-based cytosolic Ca2+ measurements showed increased Ca2+ Influx in the mutant TRPC4G503S and TRPC5 G504S-expressing cells. Apoptosis is presumably triggered by Ca2+ overload. Apoptosis could be confirmed by flow cytometry and prevented by the unspecific channel blockers of TRP channels SKF96365 and trivalent Lanthanum ions. In contrast, expression of the TRPC1G506S mutant does not lead to an increased calcium influx and TRPC1G506S-expressing cells do not show apoptosis. Modeling of TRPC4, based on the known structure of the voltage-gated potassium channel Kv1.2, predicts a conserved serin residue within the C- terminal sequence of the S6 helix as potential interaction site. Introduction of a second mutation, S623A, into TRPC4G503S supressed the constitutive activation in patch-clamp experiments (Andreas Beck). Apparently, the mutation S623A is able to partly compensate the effects by the G503S mutation in TRPC4. These results indicate that the S4-S5 linker is a critical constituent of TRPC4/C5 channel gating and that disturbance of its sequence allows channel opening independent of any sensor domain.