Proteinnachweis und Lokalisation des nicht-selektiven Kationenkanals TRPC6 am menschlichen Herzen

Abstract

1. Klinische Relevanz Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen aufgrund der immer älter werdenden Gesellschaft in Industrieländern eine zunehmend größere Rolle. Es konnte bereits gezeigt werden, dass der zellmembranständige, nicht-selektive TRPC6-Ionenkanal bei der Pathogenese von Herzerkrankungen von Bedeutung ist. Er ist unter anderem für das Calciumion permeabel, welches eine entscheidende Rolle bei der Kontraktion und Relaxation des Herzens einnimmt. Untersuchungen über den Ionenkanal werden insbesondere an Tiermodellen durchgeführt. Der TRPC6-Ionenkanal ist ein vielversprechender therapeutischer Angriffspunkt bei kardiovaskulären Erkrankungen. Ein tiefergreifendes Verständnis der physiologischen und pathophysiologischen Rolle sowie der Lokalisation von TRPC6 im humanen Herzgewebe ist die Grundlage für die Entwicklung neuer Medikamente. Wenngleich der TRPC6-Kanal in Tierversuchen und auch auf mRNA-Level beim Menschen nachgewiesen wurde, gibt es keine systematischen Untersuchungen zum TRPC6-Proteinnachweis am humanen Herzen. Ziel dieser Forschungsarbeit war der immunhistochemische Proteinnachweis des TRPC6-Ionenkanals im humanen Herzgewebe und die systematische Auswertung nach verschiedenen Lokalisationen, Strukturen und histologischen Schichten. 2. Material und Methoden Humane Gewebeproben des Herzens von insgesamt zwölf Körperspendern wurden jeweils aus dem rechten und linken Atrium, dem rechten und linken Ventrikel und dem Septum interventriculare entnommen. Die Körperspender stammen aus der Prosektur des Anatomischen Instituts der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes. Zehn der Körperspender waren NEP- (Nitritpökelsalz-Ethanol-Polyethylenglycol) fixiert und von zweien wurden die Proben unfixiert bei einem postmortalen Intervall von unter 24 Stunden entnommen. Mithilfe einer Rippenschere, eines Skalpells, verschiedener Pinzetten und anderer Instrumente konnte der Thorax eröffnet und das Herz herausgenommen werden. Von den eröffneten Atrien und Ventrikeln wurden mit einer Biopsiestanze standardisiert große Gewebeproben gewonnen. Die Biopsien wurden sofort nach der Entnahme mittels Formaldehyd-Lösung bzw. Paraformaldehyd immersionsfixiert. Für eine anschließende histologische Untersuchung wurden die Gewebeproben in Paraffin eingebettet, liegend eingeblockt, standardisiert 5 µm dicke Schnitte angefertigt und sowohl HE- als auch immunhistochemisch gefärbt. Die immunhistochemische Färbung erfolgte von ausgewählten Gewebeproben durch einen indirekten Nachweis mittels primärem, Knockout-validiertem TRPC6-Antikörper in der Verdünnung 1:100, einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper in der Verdünnung 1:500 und dem Chromogen DAB. Positivkontrollen entfielen im Sinne einer internen Kontrolle und Negativkontrollen wurden bei jedem Färbedurchgang mitgeführt. Einmalig wurde eine Spezifitätskontrolle mit einem TRPC6-Blocking-Peptid durchgeführt. Die histologischen Präparate wurden anhand des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins von TRPC6 nach Lokalisation (rechtes und linkes Atrium, rechter und linker Ventrikel, Septum interventriculare), histologischen Schichten (Epikard, Myokard, Endokard) und Strukturen (z. B. Kardiomyozyten, Bindegewebe, Gefäße) ausgewertet. 3. Ergebnisse und Interpretation Die Spezifität des Antikörpers konnte durch die Spezifitätskontrolle und durch stets negativ gefärbte Negativkontrollen gezeigt werden. Die Kardiomyozyten wiesen in jeder Lokalisation TRPC6 auf und grenzten sich von stets negativ gefärbtem Bindegewebe im Myokard ab. Die epikardialen und endokardialen Färbungen zeigten uneinheitliche Ergebnisse. Im Epikard wurde kein TRPC6 nachgewiesen und das Endokard wies insbesondere in der Lamina propria in einigen Präparaten TRPC6 auf, in anderen nicht. Die intramuskulären Arteriolen färbten sich zum überwiegenden Anteil positiv an, wohingegen die intramuskulären Venolen meist kein TRPC6 aufwiesen. TRPC6 konnte unabhängig vom Geschlecht, der Fixierungsart und der Todesursache nachgewiesen werden. 4. Ausblick Erstmalig wurde in dieser Arbeit das Protein des TRPC6-Ionenkanals im humanen Herzgewebe (außer am Herzohr) histologisch in verschiedenen Strukturen, Lokalisationen und histologischen Schichten - insbesondere in den Kardiomyozyten und den intramuskulären Arteriolen - immunhistochemisch nachgewiesen, so wie die TRPC6-Expression bereits von anderen Forschungsgruppen am Tiermodell am Herzen gezeigt werden konnte. Dieses deutet im Sinne des translationalen Konzeptes auf eine mögliche Übertragbarkeit von Forschungsergebnissen vom Tiermodell auf den Menschen hin. Dieses Ergebnis muss als Grundlage für weiterführende Untersuchungen angesehen werden. Aufgrund der steigenden Relevanz von kardiovaskulären Erkrankungen und TRPC6 als möglichem Angriffspunkt für eine medikamentöse Therapie im klinischen Alltag sollten die Forschungserkenntnisse durch weiterführende Studien ergänzt werden.

Protein detection and localisation of the non-selective cation channel TRPC6 in the human heart Due to longer lifespans in societies in industrialized countries, cardiovascular diseases are becoming increasingly important for medical research. It has already been shown that the cell membrane-bound, non-selective TRPC6 ion channel is important in the pathogenesis of heart diseases. Among other things, it is permeable to calcium ion, which plays a critical role in cardiac contraction and relaxation. The TRPC6 ion channel is a promising therapeutic target in the treatment of cardiovascular diseases. A deeper understanding of the physiological and pathophysiological role as well as the localization of TRPC6 in human cardiac tissue is the basis for new drug development. Although the TRPC6 channel has been detected in animal experiments and at the mRNA level in humans, there have been no systematic studies of TRPC6 protein detection in the human heart. For the first time, TRPC6 ion channel protein was detected histologically in human heart tissue from body donors in different structures, localizations, and histological layers - particularly in cardiomyocytes and intramuscular arterioles - by immunohistochemistry, just as TRPC6 expression has already been shown in animal models of the heart by other research groups. In the sense of the translational concept, this indicates a possible transferability of research results from animal models to humans.