Einfluss der R-CHOP Therapie auf die Verteilung und die Funktion von Immunzellen bei Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom

Abstract

Das häufig auftretende diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) wird als Standardtherapie mit einer Kombination aus Chemotherapie und dem zusätzlichen Einsatz des therapeutischen anti-CD20 Antikörpers Rituximab behandelt. Trotzdem kommt es bei ca. 30-50 % der Patienten zur Bildung eines Rezidivs oder die Patienten werden refraktär. Daher stellt eine bessere prognostische Beurteilung der Patienten einen wichtigen Schritt in der Entwicklung einer individualisierten Therapie bei Non Hodgkin Lymphomen dar. Innerhalb dieser Arbeit wurden jeweils 27 ml EDTA-Blut (3 x 9 ml) von insgesamt 33 DLBCL Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Diagnosestellung, Verlauf der Therapie und Nachsorge) analysiert, um einen Überblick über quantitative und qualitative Veränderungen der im Blut zirkulierenden Immunzellen zu erhalten. Als Referenzpunkt diente das Blut, das zum Zeitpunkt der „Diagnosestellung“ abgenommen wurde, das zudem mit Blut immunologisch gesunder Spender verglichen wurde. Im weiteren Therapieverlauf, wenn klinisch möglich, wurde das Blut jedes Patienten jeweils vor Rituximab-Gabe zu allen 6 8 Zyklen R CHOP untersucht. Nach Therapie folgte eine Blutabnahme alle drei Monate zum Nachsorgetermin, sodass der erste in diese Studie eingegangene Patient bereits über einen Zeitraum von drei Jahren untersucht wurde. Aus allen Blutproben wurden PBMC (periphere mononukleäre Zellen) aufgereinigt und durchflusszytometrisch untersucht. Folgende Subpopulationen wurden durch die Verwendung unterschiedlicher Antikörper und einer entsprechenden Gatingstrategie identifiziert: Leukozyten (Singlets, CD45+), Granulozyten (FSC A/SSC-A), Lymphozyten (CD45+/CD14-) und Monozyten (CD45+/CD14+). Die Lymphozytenpopulation wurde dann weiter unterteilt in T-Zellen (CD3+, mögliche Auftrennung in CD4+/CD8+), B-Zellen (CD19+) und NK Zellen (CD56+, CD3-, CD19-). Da die Bindung des CD20 Antikörpers Rituximab über den Fcγ-Rezeptor CD16 vermittelt wird, wurden die NK Zellen, T Zellen und Monozyten zusätzlich hinsichtlich ihrer CD16 Expression analysiert. Zudem wird die CD56 Expression in T-Zellen und Monozyten mit Tumorerkrankungen assoziiert, sodass diese Zellpopulationen auch auf ihre CD56-Expression hin untersucht wurden. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ergaben sich für den prozentualen Anteil der NK und B Zellen (gemessen an den CD45+ Leukozyten) keine Unterschiede im Vergleich zu gesunden Spendern. Der Anteil an Granulozyten und T-Zellen war überraschenderweise verringert und der Anteil an Monozyten erhöht. Hier war insbesondere auch der Anteil der CD16+ Monozyten im Vergleich zu gesunden Spendern erhöht und korrelierte negativ mit der Prognose der Patienten. Zudem zeigte sich ein zusätzlicher Anstieg der CD16+ Monozyten über den Therapieverlauf. Funktional wurde in dieser Studie das Tötungsverhalten von NK und T-Zellen im Populationskillingassay untersucht. Als Zielzelllinien wurden MHC I-defiziente K562-Zellen (natürliche Zytotoxizität) und die CD20+ DLBCL-Zelllinie U-2932 verwendet. Das Killing der U 2932 wurde über Rituximab vermittelt, wobei der Fc-Teil an CD16+ NK bzw. T Zellen bindet, um eine Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu induzieren. Hierbei zeigte sich keine veränderte Zytotoxizität der NK Zellen sowohl im Therapieverlauf als auch im Vergleich zu gesunden Kontrollspendern. Das T-Zellkilling war hingegen sowohl Rituximab spezifisch gegen U 2932 als auch gegen K562 Zellen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die für diese Zytotoxizität verantwortlichen Zellen sind wahrscheinlich unkonventionelle T-Zellen, wie NKT-Zellen oder  T-Zellen. Diese Zellen lysieren ihre Zielzelllinien Antigen-unspezifisch und werden mit wichtigen Funktionen bei der Tumorimmunität in Zusammenhang gebracht. Die genaue Bestimmung der verantwortlichen Zellen ging über den Rahmen dieser Studie hinaus, wird aber innerhalb unserer Arbeitsgruppe weiter untersucht, da das Vorhandensein der Zellen im Blut bei DLBCL Patienten ein wichtiger immunologischer Parameter sein könnte. Mit dieser Studie wurde die Aufreinigung, die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse von Blutproben von DLBCL Patienten in unserem Labor grundlegend etabliert. Daraus haben sich Folgearbeiten, wie die genetische Untersuchung unterschiedlicher Polymorphismen, Zytokin- und Vitamin D-Spiegel Analysen im Plasma und die Bestimmung weiterer Oberflächenrezeptoren, z.B. mittels CyTOF, ergeben. Damit erhoffen wir uns weitere immunologisch relevante Unterschiede zu finden bzw. die in dieser Studie bereits gefundenen Unterschiede genauer zu charakterisieren, um eine diagnostische oder prognostische Relevanz bestimmen zu können.

The standard therapy for the common diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a combination of chemotherapy (CHOP) with the additional use of the therapeutic anti CD20 antibody Rituximab. Nevertheless, approximately 30-50 % of patients develop a relapse or become refractory. Therefore, a better prognostic assessment of patients represents an important step in the development of individualized therapy for non-Hodgkin lymphoma. Within this work, 27 ml EDTA blood (3 x 9 ml) each from a total of 33 DLBCL patients were analysed at different time points (diagnosis, course of therapy and follow-up) to obtain an overview of quantitative and qualitative changes of the immune cells circulating in the blood. The blood samples taken at the time of "diagnosis" served as the reference point and was compared with blood samples from healthy controls. In the further course, when clinically possible, the blood of each patient was analysed every 6-8 cycles of R-CHOP before rituximab administration. After therapy, blood sampling followed every three months at the follow-up appointment, so that the first patient included in this study had already been examined over a period of three years. PBMC (peripheral blood mononuclear cells) were purified from all blood samples and analysed by flow cytometry. The following subpopulations were identified by using different antibodies and an appropriate gating strategy: leukocytes (singlets, CD45+), granulocytes (FSC A/SSC-A), lymphocytes (CD45+/CD14-) and monocytes (CD45+/CD14+). The lymphocyte population was then further subdivided into T cells (CD3+, possible separation into CD4+/CD8+), B cells (CD19+) and NK cells (CD56+, CD3-, CD19-). Since the binding of the CD20 antibody rituximab is mediated by the Fcγ receptor CD16, the NK cells, T cells and monocytes were additionally analysed for their CD16 expression. In addition, CD56 expression in T cells and monocytes is associated with tumour disease, consequently these cell populations were also analysed for CD56 expression. At the time of diagnosis, there were no differences in the percentage of NK and B cells (measured by CD45+ leukocytes) compared with healthy donors. Surprisingly, the percentage of granulocytes and T cells was decreased and the percentage of monocytes was increased. In particular, the proportion of CD16+ monocytes was also increased compared to healthy controls and correlated negatively with the prognosis of the patients. Furthermore, an additional increase of CD16+ monocytes was shown over the course of therapy. Functionally, this study investigated the killing behaviour of NK and T cells in the population killing assay. MHC I-deficient K562 cells (natural cytotoxicity) and the CD20+ DLBCL cell line U-2932 were used as target cell lines. Killing of U 2932 was mediated via rituximab, with the Fc portion binding to CD16+ NK or T cells to induce antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). Here, there was no altered cytotoxicity of NK cells both during the course of therapy and compared to healthy controls. In contrast, T cell killing was significantly increased, both rituximab-specific against U-2932 and against K562 cells at the time of diagnosis compared to the control group. These cells lyse their target cell lines in an antigen-unspecific manner and are associated with important functions in tumour immunity. The exact determination of the responsible cells was outside the frame of this study, but will be further investigated within our group, as the presence of these cells in the blood might be an important immunological parameter in DLBCL patients. This study fundamentally established the purification, flow cytometric and functional analysis of blood samples from DLBCL patients in our laboratory. This has resulted in follow-up work, such as the genetic investigation of different polymorphisms, cytokine and vitamin D level analyses in plasma, and the determination of additional surface receptors, e.g., by CyTOF. Thus, we hope to find further immunologically relevant differences or rather to characterize the differences already found in this study more precisely in order to be able to determine a diagnostic or prognostic relevance.