Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der Adhäsion opportunistisch-pathogener Mikroorganismen auf authentischen, klinisch-relevanten Oberflächen

Abstract

Die Rasterkraftmikroskopie-basierte, Einzelzell-kraftspektroskopische Quantifizierung der Adhäsionsstärke von opportunistisch-pathogenen Mikroorganismen auf klinisch-relevanten Oberflächen, wie dem Zentralen Venenkatheter oder dem Zahnschmelz, ermöglichen es, den biophysikalischen Mechanismus hinter der Adhäsion besser zu verstehen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Adhäsion von individuellen Staphylococcus aureus-Zellen auf Zentralen Venenkathetern und von Candida albicans-Zellen auf Zahnschmelz untersucht. Dabei standen ihre Adhäsionsvermögen an die jeweiligen nativen Substratoberflächen sowie von S. aureus in Gegenwart von humanem Blutplasma und von C. albicans in Gegenwart von humanem Speichel im Vordergrund. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Adhäsionskräfte von S. aureus auf Zentralen Venenkathetern und von C. albicans auf Zahnschmelz auf den unbehandelten Substratoberflächen im geringen ein- bis zweistelligen Nanonewton-Bereich bewegten. Eine Biokonditionierung der Substratoberflächen mit humanem Blutplasma oder mit Speichel zeigte einen unterschiedlichen Effekt bei der Adhäsion: Während eine Speichelbeschichtung des Zahnschmelzes die Adhäsionskräfte von C. albicans-Zellen signifikant erhöhte, führte eine Blutplasmabeschichtung des Zentralen Venenkatheters zu einer signifikanten Reduzierung der Adhäsionskräfte von S. aureus. Die starke Adhäsion von C. albicans auf speichelbeschichtetem Zahnschmelz konnte auch auf oral-behandelten, in situ-biokonditionierten Zahnschmelzprüfkörpern gezeigt werden. Aufgrund des starken negativen Effekts von humanem Blutplasma auf das initiale Adhäsionsvermögen von S. aureus auf Zentrale Venenkathetern wurden weiterführende Studien der Einzelzellkraftspektroskopie mit explantierten Zentralen Venenkathetern aus der Klinik, oder nach Adsorption von ausgewählten Blutplasmaproteinen auf dem Substrat durchgeführt. Explantierte Substratoberflächen zeigten dabei eine ähnliche Minimierung der Adhäsionskräfte wie nach einer in vitro-Behandlung des Substrats mit humanem Blutplasma. Unter den ausgewählten Blutplasmaproteinen konnte Humanes Serumalbumin als ein starker negativer Effektor der Adhäsion von S. aureus auf Zentralen Venenkathetern identifiziert werden. Fibrinogen, ein in der Literatur etablierter Faktor bei der Adhäsion von S. aureus, induzierte interessanterweise ebenfalls eine Abnahme der Adhäsionskräfte, jedoch in einem begrenzteren Umfang als humanes Serumalbumin. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in dieser Arbeit die Rasterkraftmikroskopie-basierte Einzelzellkraftspektroskopie erstmalig auf authentischen, klinisch-relevanten Oberflächen durchgeführt wurde. Substratoberflächen wurden ebenfalls in vitro mit relevanten Körperflüssigkeiten behandelt, die einen starken Effekt auf die Adhäsion des jeweiligen Mikroorganismus ausübten. Die resultierende Adhäsionsstärke war auf diesen biokonditionierten Substratoberflächen und auf ex situ isolierten bzw. in situ-behandelten Substratoberflächen vergleichbar, was ein klares Indiz dafür darstellt, dass die in vitro produzierten Daten ein gutes Abbild der in vivo-Situation wiedergeben. Die Einzelzellkraftspektroskopie wurde auch zur Bestimmung der Adhäsionsstärke von S. aureus auf Endothelzellen nach Inaktivierung des Hitzeschockproteins ClpC, einem Modulator der bakteriellenxiv Überlebensfähigkeit in Wirtszellen, angewendet. Hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Adhäsionsstärke zwischen einem ClpC-produzierenden S. aureus-Stamm und einer clpCDeletionsmutante. Daraus konnte gefolgert werden, dass das ClpC-abhängige Überleben des Bakteriums in der Wirtszelle nicht über eine Regulation des bakteriellen Adhäsionsvermögens an die Wirtszelloberfläche erfolgt.

Atomic force microscopy-based single-cell force spectroscopy enables the quantification of the adhesion strength of microorganisms to clinically relevant surfaces, such as central venous catheters or tooth enamel surfaces. With this technique, it is possible to uncover biophysical adhesion mechanisms, which have not been discovered yet. In this work, the adhesion strengths of Staphylococcus aureus to the tubing of central venous catheters and of Candida albicans to tooth enamel specimen were investigated. Chiefly, the adhesion of individual cells of each species was tested to the respective naïve surfaces, as well as to human blood plasmatreated central venous catheters for S. aureus, and to saliva-treated tooth enamel for C. albicans. The results show that the adhesion forces for S. aureus to the catheter and for C. albicans to the tooth enamel were in the lower nanonewton range. When surfaces were preincubated with the respective bodily fluids, we found a different effect on adhesion: While a coating of tooth enamel with saliva resulted in a significant increase of C. albicans adhesion forces, the deposition of human blood plasma reduced the adhesion forces of S. aureus significantly. The strong adhesion of C. albicans to saliva-treated tooth enamel could also be reproduced on orally treated, in situ-coated tooth enamel specimen. Due to the strong negative impact of human blood plasma on the adhesion capacity of S. aureus to central venous-catheter tubing, further single-cell force spectroscopy studies were conducted with explanted central venous catheters from the clinics or after coating the substrate surface with selected blood plasma proteins. S. aureus cells tested on explanted surfaces showed a similar reduction in adhesion forces as observed with the in vitro-treated catheter surfaces. Among selected blood plasma proteins, human serum albumin was identified as a negative effector of the adhesion of S. aureus to central venous catheters. Fibrinogen, a factor known to promote adhesion of S. aureus to host cells and tissues, interestingly, also induced a reduction of adhesion forces, albeit not to the same degree as albumin. In conclusion, this work established atomic force microscopy-based single-cell force spectroscopy for the first time on authentic, clinically relevant surfaces. Substrate surfaces were either untreated or treated in vitro with the relevant bodily fluids, which had a tremendous effect on the adhesion of the microorganisms to the respective surface. Importantly, the resulting adhesion strengths were comparablexvi to the adhesion strengths recorded on ex vivo- or in situ-coated substrate surfaces, suggesting that the in vitro data produced with this assay can be related to the in vivo situation. Furthermore, this technique could be used to quantify the adhesion strength of S. aureus to endothelial cells after inactivation of ClpC, a modulator of bacterial survival in host cells. Here, no significant difference was found in the adhesion strengths between a ClpC-producing S. aureus and a clpC deletion mutant. It was concluded that the ClpC-dependent survival of the bacterium in the host cell does not result from a regulation of the adhesion strength to the epithelial cell surface.