Vergleichende Expressionsanalyse der microRNAs 21, 34a, 200a und 409 in Tumorgewebe und Blutplasma von Meningeompatienten

Abstract

Meningeome sind eine Gruppe überwiegend benigner, langsam wachsender Neoplasien des Zentralen Nervensystems (ZNS), die ihren Ursprung in den meningothelialen Arachnoidalzellen haben. Die Exposition mit ionisierender Strahlung gilt derzeit als einzig gesichertes Umweltrisiko für ihre Entstehung. Sie machen etwa ein Drittel aller primären intrakraniellen Tumore aus. Obwohl Meningeome als gutartig angesehen werden, sind sie dennoch Ursache gravierender Morbidität und erhöhter Mortalität. Meningeome werden nach der Tumorklassifikation der World Health Organization (WHO) in drei verschiedene histologische Grade (WHO Grad I-III) eingeteilt. Die Standardtherapie ist die chirurgische Resektion bzw. die Strahlentherapie für chirurgisch nicht resezierbare Tumore. Nach Resektion kommt es dennoch bei etwa 20 % der operierten Patienten* zu Rezidiven, deren Ätiologie Ansatzpunkt für diverse Forschungsprojekte ist. Meningeome weisen in etwa 60 % aller Fälle eine Monosomie des Chromosoms 22 auf. Eine Tumorprogression ist häufig mit einem nicht zufälligen Verlust weiterer Chromosomen bzw. chromosomaler Abschnitte verbunden. Ein besonderer Fokus liegt hierbei auf der Deletion des kurzen Arms des Chromosoms 1 (1p), die unabhängig von der jeweils vorliegenden WHO-Klassifikation mit einem signifikant erhöhten Rezidivrisiko einhergeht.

Neben genetischen haben auch epigenetische Faktoren einen maßgeblichen Einfluss auf den Verlauf von Tumorerkrankungen. Dies betrifft beispielsweise den Prozess der RNA-Interferenz. Bei der RNA-Interferenz heften sich kurze, nicht proteinkodierende RNA-Moleküle an bereits transkribierte messenger-RNAs (mRNAs) und hemmen posttranskriptionell die Genexpression. Beispiele für nichtproteinkodierende RNAs sind microRNAs, welche mit assoziierten Proteinen zu den häufigsten Ribonukleoprotein-Komplexen der Zelle gehören. Da microRNAs steuernd auf die Genexpression wirken können, kommt ihnen eine zentrale Rolle in der Regulation der Tumorsuppressorgene und Onkogene zu. In vielen malignen Tumoren konnte bereits eine Hoch- bzw. Herunterregulierung von microRNAs im Vergleich zu dem jeweiligen gesunden Gewebe nachgewiesen werden. MicroRNAs können aus einer Vielzahl biologischer Gewebe und Flüssigkeiten isoliert werden, darunter auch aus Blut. In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass im soliden Meningeom verschiedene microRNAs im Vergleich zu gesundem Arachnoidalzellgewebe hoch- oder herunterreguliert sind. Die microRNAs 21, 34a, 200a und 409 sind auf Chromosomenabschnitten lokalisiert, die beim Meningeom progressionsabhängig typische Aberrationen aufweisen. Primäres Ziel dieser Promotionsarbeit war es herauszufinden, ob die Expressionsmuster dieser vier microRNAs mit dem Rezidivverhalten von Meningeomen in Verbindung gebracht werden können. Ein weiteres Ziel war es zu detektieren, ob die vier gewählten microRNAs nicht nur im soliden Tumor, sondern auch zeitgleich im Blut der Betroffenen analysierbar sind. Um die epigenetische mit der molekularzytogenetischen Ebene in Relation zu setzen, wurden bei den untersuchten Meningeomen die Expressionsmuster der microRNAs mit den Ergebnissen einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hinsichtlich Aberrationen der Chromosomen 1, 9, 10, 14, 18 und 22 verglichen.

Zu diesem Zweck wurden 51 Tumor- und Blutproben asserviert. Nach der Isolation der RNA und der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion wurden die Expressionsmuster der gewählten microRNAs aus dem Tumorgewebe und Blut mittels Realtime-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) untersucht. Im Zuge der erfolgreichen Neuetablierung der RNU6B als endogene Kontrolle der Expressionsmuster der analysierten microRNAs im Blutplasma von 43 Patienten wurden deren Tumor- und Blutproben in die Auswertung dieser Promotionsarbeit eingeschlossen.

Eine signifikante Korrelation der Expressionsmuster der jeweiligen microRNAs zwischen Tumor und Blut konnte nicht detektiert werden. Die im Tumor detektierte microRNA 200a zeigte als einzige untersuchte microRNA eine signifikant geringere Expression bei Rezidiven als bei erstdiagnostizierten Meningeomen (p = 0,009). Bei dem Vergleich zwischen der Expression der microRNA 409 im Tumor und dem Tumorvolumen konnte eine signifikante Korrelation festgestellt werden (p = 0,043). Die Expression der microRNA 409 im Tumor korrelierte signifikant negativ mit dem Alter der untersuchten Patientenkohorte (p = 0,012). Beim Vergleich des Blutes von Meningeompatienten mit gesunden Probanden konnte im Bereich der untersuchten microRNAs ein signifikanter Unterschied detektiert werden: die Expression der microRNA 200a im Blut der männlichen Kohorte zeigte sich bei Patienten signifikant höher exprimiert als bei den gesunden Probanden (p = 0,016). Bei der weiblichen Stichprobe fand sich hingegen kein signifikanter Unterschied. Bezüglich der microRNAs 21, 34a und 409 konnte bei beiden Geschlechtern kein signifikanter Unterschied gefunden werden.

Die Gene für die microRNAs 34a und 200a sind auf dem Chromosomenabschnitt 1p und für die microRNA 409 auf dem Chromosom 14q lokalisiert. Die Expressionsmuster dieser microRNAs korrelierten bezogen auf den soliden Tumor jeweils hochsignifikant mit den Ergebnissen der Aberrationen in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) für den jeweiligen Chromosomenabschnitt (p ≤ 0,001). Der kurze Arm des Chromosoms 1 (1p) war bei Rezidiven signifikant öfter von Verlusten betroffen als bei Erstdiagnosen (p = 0,013). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Meningeome der Konvexität signifikant häufiger Verluste des Chromosoms 22 aufweisen als Tumore der Schädelbasis (p = 0,011). Dies traf auch auf den kurzen Arm des Chromosoms 1 zu (p = 0,043). Tumore des WHO Grads II wiesen im Bereich des Chromosomenabschnittes 1p häufiger Verluste auf als Meningeome des WHO Grads I (p = 0,001).

Die Detektion der microRNA 200a als Rezidivmarker, der sich von der jeweiligen Expression in erstdiagnostizierten Meningeomen signifikant unterscheidet, ist als Hauptergebnis dieser Promotionsarbeit anzusehen. In diesem Zuge konnte erstmals ein auf dem Chromosomenabschnitt 1p lokalisierter, WHO Grad unabhängiger Rezidivmarker für Meningeome auf der epigenetischen Ebene detektiert werden.

*Aus Gründen der Lesbarkeit wird im Text dieser Promotionsarbeit durchgängig die männliche Form der Darstellung gewählt, falls kein Geschlecht gesondert hervorgehoben werden soll. Selbstverständlich wird dabei auch immer das nicht männliche Patientengut inkludiert.

Meningiomas are predominantly benign and slowly growing neoplasms of the central nervous system originating from meningothelial arachnoid cells. Exposure to ionizing radiation currently is the only proved environmental risk for its occurrence. Meningiomas represent about one third of all primary intracranial tumors. Although mostly benign, they cause serious morbidity and increased mortality. Meningiomas are divided into three different histological grades (WHO grades I-III) according to the tumor classification of the World Health Organization (WHO). Standard therapy is surgical resection or radiation for surgically unresectable tumors. After tumor resection, however, about 20 % of the operated patients show recurrences. The etiology of recurrences is the topic of various research projects. Meningiomas show monosomy of chromosome 22 in about 60 % of all cases. Tumor progression is often associated with a nonrandom pattern of losses of additional chromosomes or parts of chromosomes. Particularly focused is 1p deletion, which is associated with a significantly increased risk of recurrence and is independent of the histological classification (WHO).

In addition to genetic factors, epigenetic pathways also have a decisive influence on the course of tumor diseases. This applies, for example, to the process of RNA interference. In the process of RNA interference, short non-protein-coding RNA molecules pair with already transcribed messenger RNAs (mRNAs) and inhibit gene expression after transcription. MicroRNAs are non-protein-coding RNAs. With associated proteins they constitute one of the most prevalent ribonucleoprotein complexes in cells. Since microRNAs can control gene expression, they play a central role in the regulation of tumor suppressor genes and oncogenes. In various malignant tumors upregulation or downregulation of microRNAs compared to non-affected tissue has already been detected. MicroRNAs can be isolated from a wide variety of biological tissues and fluids, including blood. Various studies showed that in solid meningiomas several microRNAs are upregulated or downregulated compared to normal arachnoid cell tissue. The microRNAs 21, 34a, 200a and 409 are located on parts of chromosomes which show typical progression-dependent aberrations in meningiomas. The primary goal of this research project was to find out whether the expression patterns of these four microRNAs are associated with the recurrence of meningiomas. Another goal was to learn whether the four selected microRNAs can be detected not only in the solid tumor but also in the blood of the patients. In order to compare the molecular-cytogenetic with the epigenetic level, the expression patterns of microRNAs in the examined meningiomas were set in relation to aberrations of chromosomes 1, 9, 10, 14, 18 and 22 by using fluorescence in situ hybridization (FISH). The results were compared to the expression patterns of the respective microRNAs. For this purpose, 51 tumor and blood samples were collected. After isolation of the RNA and processing of the reverse transcription polymerase chain reaction, expression patterns of selected microRNAs from tumor tissue and blood were analyzed by using real time polymerase chain reaction (qPCR). After successful validation of RNU6B as an endogenous control in the plasma of 43 patients, these tumor and blood samples were included in a detailed analysis within this research project.

A significant correlation of the microRNA expression patterns between tumor and blood could not be detected. MicroRNA 200a was expressed at a significantly lower level in recurrences of meningiomas than in newly diagnosed tumors (p = 0.009). The expression of microRNA 409 in tumor showed a significant correlation with the tumor volume (p = 0.043). The expression of microRNA 409 in tumor was negatively correlated with the age of the patients. This difference was statistically significant (p = 0.012). Comparing the blood of meningioma patients with healthy volunteers, a significant difference could be detected in the examined microRNAs of the male cohort: the expression of microRNA 200a in the blood of the male patients was significantly higher than in healthy male volunteers (p = 0.016). In the female cohort, however, there was no significant difference. With regard to microRNAs 21, 34a and 409, no significant difference could be found in either sex.

The genes of microRNAs 34a and 200a are located on chromosome 1p, whereas microRNA 409 is located on chromosome 14. In the solid tumor, the expression patterns of these microRNAs were significantly correlated (p ≤ 0.001) with aberrations in fluorescence in situ hybridization (FISH) of the respective chromosome. In recurrences, the short arm of chromosome 1 (1p) was significantly more frequently affected by losses than in newly diagnosed meningiomas (p = 0.013). Furthermore, it was detected that tumors of convexity had significantly more frequent losses of chromosome 22 than skull base meningiomas (p = 0.011). This also was true for the short arm of chromosome 1 (1p) (p = 0.043). WHO grade II tumors showed more frequent losses in chromosome 1p region than WHO grade I meningiomas (p = 0.001).

The main result of this research project is the detection of a new biomarker for recurrence of meningiomas: Expression of microRNA 200a differs significantly in newly diagnosed meningiomas compared to recurrent meningiomas. For the first time a histologically (WHO) independent biomarker for recurrence localized on chromosome 1p was developed at the epigenetic level.