Pharmakologische Modulation des Ca2+-Leckstroms aus dem Endoplasmatischen Retikulum mittels chemischer Chaperone

Abstract

In all eukaryotic cells, the endoplasmic reticulum (ER) functions as a major site of protein synthesis and as main releasable Ca2+ storage organelle. Thus, ER is crucial for the cellular Ca2+-homeostasis in which the Sec61 complex, located in the ER membrane, serves as a protein translocase while also acting as Ca2+ leak channel allowing Ca2+ ions permeate into the cytosol. This aforementioned effect is referred to as Ca2+ efflux which is known to utilize regulatory Proteins available in the cytosol and ER Lumen including, but not limited to the ER luminal protein termed BiP. BiP belongs to the protein folding group named Chaperones which assist in protein folding and also suppresses Ca2+ leak from the ER. Furthermore, ER stress may cause Ca2+ leak from the ER into the cytosol altering cellular Ca2+ homeostasis to the point of apoptosis. Among other mechanisms, chemically produced chaperones, which induce protein folding, have also been shown to protect cells from ER stress. However, to this date studies are insufficient in identifying possible direct effects of chemical chaperones on cellular Ca2+ homeostasis and Ca2+ leak. This scientific research aims to explore and characterize comparatively and functionally the Ca2+ leak by using known Sec61 modulators independently, as well as in combination with two chemical chaperones known as 4-phenylbutyrate (4-PBA) and azoramide (AZO). For this purpose, Ca2+ imaging experiments using the cytosolic Ca2+ indicator Fura-2 were performed on human HEK-293 cells and their cellular Ca2+ homeostasis. A 12-minute treatment with aformentioned pharmacological agents 4-PBA or AZO resulted in a reduction of Ca2+ leak up to ~75%. Also, after pharmacological induced ER stress, treatment with the two chemical chaperones resulted in a significant reduction of Ca2+ leak also up to ~75% compared against the control group. In addition, a dose-dependent effect could be highlighted for 4-PBA and AZO, whereas prolongation of treatment with 4-PBA to 30 minutes resulted in a smaller reduction of Ca2+ efflux. The active metabolite phenyl acetate (PAA) decreased cytosolic Ca2+ leak by more than ~50%. Furthermore, incubation with 4-PBA was shown to result in a ~50% reduction in total cellular Ca2+ content. In conclusion these results indicate that chemical chaperones may have a protective effect on ER-stressed cells and positively influence Ca2+ homeostasis and/or Ca2+ leak.

In allen eukaryotischen Zellen fungiert das Endoplasmatische Retikulum (ER) als Zellorganell der Proteinsynthese und als Hauptspeicherorganell für Ca2+ und ist somit entscheidend für die Ca2+-Homöostase der Zelle. Der in der ER-Membran befindliche Sec61-Komplex dient hierzu als Proteintranslokase und wurde zudem als ein Ca2+-Leckkanal beschrieben, durch den Ca2+-Ionen in das Zytosol permiieren. Zur Regulation dieses Ca2+-Efflux stehen im Zytosol und ER-Lumen Proteine zur Verfügung, zu denen auch das im ER befindliche BiP gehört. BiP zählt zu der Gruppe von Faltungshilfsprotein, die sog. Chaperone, und unterdrückt darüber hinaus das Ca2+-Leck aus dem ER. ER-Stress führt zu einem ungewollten Ca2+-Leck aus dem ER in das Zytosol, was die Ca2+-Homöostase der Zelle bis hin zur Apoptose verändert. Es hat sich gezeigt, dass chemisch hergestellte Chaperone unter anderem auch über dem Mechanismus der Proteinfaltung Zellen vor ER-Stress schützen können. Bisher ist jedoch der direkte Effekt von chemischen Chaperonen auf die Ca2+-Homöostase und das Ca2+-Leck von Zellen unzureichend untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es das Ca2+-Leck durch Verwendung von bekannten Sec61-Modulatoren gesondert, sowie in Kombination mit zwei chemischen Chaperone 4-Phenylbutyrat (4-PBA) und Azoramide (AZO) vergleichend und funktionell zu erforschen. Hierzu wurden Ca2+-Imaging-Experimente mittels des zytosolischen Ca2+-Indikators Fura-2 an humanen HEK-293 Zellen durchgeführt und die Ca2+-Homöostase dieser Zellen sowie deren Änderungen nach Behandlung mit obengenannten pharmakologischen Stoffen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine 12-minütige Behandlung mit 4-PBA oder AZO zu einer Reduktion des Ca2+-Lecks bis hin zu ~75% führte. Auch nach pharmakologische induzierte ER-Stress führte die Behandlung mit den beiden chemischen Chaperonen zu einer deutlichen Reduktion des Ca2+-Lecks ebenfalls bis hin zu ~75% im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zusätzlich ließ sich ein dosisabhängiger Effekt für 4-PBA und AZO herausstellen, wohingegen die Verlängerung der Behandlung mit 4-PBA auf 30 Minuten in einer geringeren Senkung des Ca2+-Efflux resultierte. Der aktive Metabolit Phenylacetat (PAA) verringerte das zytosolische Ca2+-Leck um mehr als ~50%. Ferner zeigte sich, dass die Inkubation mit 4-PBA zu einer Verringerung des gesamten zellulären Ca2+-Gehaltes um ~50% führte. Diese Ergebnisse legen den Verdacht nahe, das chemische Chaperone möglicherweise einen protektiven Effekt auf unter ER-Stress stehende Zellen aufweisen und die Ca2+-Homöostase bzw. das Ca2+-Leck positiv beeinflussen.