Qualitative and quantitative assessment of cornea guttata and endothelial cell loss in the human donor cornea

Abstract

In contrast to penetrating keratoplasty (PKP), where all the layers of the donor cornea are transplanted, Descemet´s membrane endothelial keratoplasty (DMEK) designates the transplantation of only the Descemet´s membrane and the endothelial layer of the donor cornea which together form a thickness of 20-30 µm. The total number of corneal transplantations in Germany has drastically increased between the years 2001 to 2020 from 4730 to 9042 keratoplasties, whereby DMEKs have surpassed PKP since 2014. In light of this constantly growing number, the need to increase not only the number but also the quality of the donor corneas is paramount. Therefore, an essential part of the quality control of the donor corneas in the eye banks is ensuring a healthy and functional endothelial layer since it plays an important role in maintaining the clarity of the cornea and, thus, a satisfying postoperative visual acuity. Yet, postoperative complications related to endothelial failure still appear in 3% to 7% of cases. Accordingly, the purpose of the following publications was to enhance the quality control of the endothelial layer of the donor corneas. This was achieved by studying the impact of two important factors on the endothelial layer of the donor cornea: 1) The preparation and storage of the DMEK roll (DR), as well as 2) Cornea guttata (CG). In the first paper, a novel, reproducible, and non-invasive method was introduced to quantify endothelial cell loss (ECL) of the DR caused by its preparation and storage for 5 days. After the preparation of DRs, the tissues were placed in their storage medium containing organ culture medium 1 without dextran. Non-invasive and reproducible ECL measurements followed both before the preparation and directly after the preparation, as well as on days 1, 2 and 5 after storage using inverted light microscopy. The results showed an ECL of 11% due to the preparation procedure and 12% due to the 5 days storage of the tissues. Based on the results of these non-invasive measurements that proved to be highly reproducible with Cronbach's alpha values between 0.85 and 0.98, shipping of DRs after several days of storage to be used in a DMEK is debatable. To avoid excessive ECL and to maintain good quality of the donor endothelial layer, we recommend a storage time of the DR as short as possible. The second paper determined the prevalence and severity of CG in grafts after PKP and investigated its clinical significance during the postoperative follow-up. In this retrospective study, it was shown that the prevalence of CG was 14.9%, the majority of which showed mild CG (G1) 13.6% and only 1.3% showed high-grade CG (G2 and G3). The mean corneal thickness, pleomorphism and polymegalism were significantly affected by high-grade CG. A progression to a higher grade of CG was detected in 16.8% of the CG cases during long term follow-up. The third paper investigated the prevalence and severity of CG in grafts after DMEK and assessed its impact on various clinical parameters during the postoperative follow-up. CG appeared postoperatively in 18.7% of the grafts. 16.9% of those could be classified as mild CG (G1), and 1.9% as high-grade CG (G2 and G3). A significant clinical deterioration with increasing grades of CG was found in the following parameters: corrected distance visual acuity (CDVA), central corneal thickness, pleomorphism, and polymegalism. Fortunately, the second and third papers proved that only high-grade CG have a significant clinical impact on the patients during the postoperative follow-up examinations. Due to the high prevalence of CG demonstrated in the above-mentioned papers and the negative impact of high-grade CG on the postoperative clinical parameters, the fourth paper aimed to detect CG in the donor corneas before their transplantation. Therefore, semi-quantitative criteria for the detection of CG in the donor corneas in the eye bank were introduced. This retrospective study was able to show that three criteria that can be detected in the eye bank using inverted light microscopy seem to correlate with postoperative CG: 1) The presence of blebs (a small hyperdense thickening of the cell membrane), 2) the presence of cell membrane defects and interruptions, as well as 3) endothelial pictures with less than 50% of the cells having a hexagonal or circular shape.

Im Gegensatz zur perforierenden Keratoplastik (PKP), bei der alle Schichten der Spenderhornhaut transplantiert werden, bezeichnet die Descemet-Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) nur die Transplantation der hinteren Korneaschichten. Das aus der Endothelschicht und der Descemet-Membran bestehende Transplantat hat eine Dicke von 20-30 µm. Die Gesamtzahl der Hornhauttransplantationen in Deutschland ist zwischen den Jahren 2001 und 2020 von 4730 auf 9042 Keratoplastiken drastisch angestiegen, wobei die DMEK seit 2014 die PKP zahlenmäßig überholt hat. Angesichts dieser stetig wachsenden Zahl ist es notwendig, nicht nur die Anzahl, sondern auch die Qualität der Spenderhornhäute zu erhöhen. Daher ist vor allem die Sicherstellung einer gesunden und funktionellen Endothelschicht ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle zur Eignung der Spenderhornhäute für die Transplantation. Das Endothel ist dabei besonders für die Erhaltung der postoperativen Klarheit der Hornhaut verantwortlich. Dennoch kommt es in 3% bis 7% der Fälle zu postoperativen Komplikationen die in Zusammenhang mit einem Endothelversagen stehen. Das Ziel der folgenden Arbeit war es daher, die präoperative Qualitätskontrolle des Spenderendothels durch die Untersuchungen der folgenden Faktoren zu verbessern: 1) Die Durchführung der Präparation und Lagerung der DMEK-Rolle (DR) und 2) das Vorhandensein von Cornea guttata (CG). In der ersten Arbeit wurde eine neuartige, reproduzierbare und nicht-invasive Methode zur Quantifizierung der Endothelzellverluste (ECL) der DR vorgestellt, die durch deren Präparation und Lagerung für 5 Tage verursacht werden. Nach der Vorbereitung der DR wurden die Gewebe in ihr Lagermedium (Organkulturmedium 1 ohne Dextran) gelegt. Mittels inversem Mikroskop wurden dabei nicht-invasive und reproduzierbare ECL-Messungen sowohl vor der Präparation als auch direkt nach der Präparation an den Tagen 1, 2 und 5 nach der Lagerung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine ECL von 11% aufgrund des Präparationsverfahrens und 12% aufgrund der 5-tägigen Lagerung des Gewebes. Basierend auf die Ergebnisse dieser nicht-invasiven Messungen, die sich mit Cronbachs Alpha-Werten zwischen 0,85 und 0,98 als hoch reproduzierbar erwiesen haben, ist der Versand von DR nach mehrtägiger Lagerung zur Verwendung für eine DMEK umstritten. Um einen übermäßigen ECL zu vermeiden und eine gute Qualität der Spenderendothelschicht zu erhalten, empfehlen wir eine möglichst kurze Lagerungszeit der DR. In der zweiten Arbeit wurden die Prävalenz und der Schweregrad von CG in Transplantaten nach PKP bestimmt und ihre klinische Bedeutung während der Nachuntersuchungen ermittelt. In dieser retrospektiven Studie zeigte sich, dass die Prävalenz von CG bei 14,9% lag. Dabei konnte in den meisten Fällen eine leichte CG (G1) 13,6% und nur in 1,3% eine hochgradige CG (G2 und G3) nachgewiesen werden. Die mittlere Hornhautdicke, der Pleomorphismus und der Polymegalismus waren bei der hochgradigen CG signifikant erhöht. Bei 16,8% der CG-Fälle wurde während der langfristigen Nachbeobachtungszeit eine Progression zu einem höheren CG-Grad festgestellt. Die dritte Arbeit untersuchte die Prävalenz und den Schweregrad von CG in Transplantaten nach DMEK und bewertete ebenfalls ihren Einfluss auf verschiedene klinische Parameter während der postoperativen Nachsorge. CG traten postoperativ bei 18,7% der Transplantate auf. Dabei konnten 16,9% als leichte CG (G1) und 1,9% als hochgradige CG (G2 und G3) klassifiziert werden. Eine signifikante klinische Verschlechterung mit zunehmendem Grad der CG wurde bei folgenden Parametern festgestellt: korrigierter Fernvisus (CDVA), zentrale Hornhautdicke, Pleomorphismus und Polymegalismus. Zusammenfassend zeigten die Studien zwei und drei, dass nur hochgradige CG bei den postoperativen Nachuntersuchungen einen signifikant negativen klinischen Einfluss auf die postoperativen Ergebnisse hatte. Aufgrund der wie in den oben genannten Studien auftretenden hohen Prävalenzen von CG und deren negativen Einflusses in hochgradigen Stadien, zielte die vierte Arbeit darauf ab, CG in den Spenderhornhäuten präoperativ zu ermitteln. Dazu wurden semiquantitative Kriterien für den Nachweis von CG in den Spenderhornhäuten in der Hornhautbank untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass drei verschiedene Kriterien, die in der Hornhautbank mit Hilfe des inversen Mikroskops erkannt werden können, mit dem Vorhandensein einer CG korrelieren: 1) das Vorhandensein von so genannten “Blebs“ (kleine fokale Verdichtungen der Zellmembran), 2) das Vorhandensein von Zellmembrandefekten und -unterbrechungen und 3) Endothelbilder, bei denen weniger als 50% der Zellen eine hexagonale oder kreisförmige Form aufwiesen.