Regulation of protein transport into the ER by phosphorylation of Sbh1/Sec61β

Abstract

The ER protein translocation channel subunit Sbh1 is non-essential, but contains multiple phosphorylation sites suggesting a regulatory role in ER protein import. It has been already shown that mutating two N-terminal, proline-flanked, phosphorylation sites in the Sbh1 cytosolic domain phenocopies the temperature-sensitivity of a yeast strain lacking SBH1/SBH2, and results in reduced translocation into the ER of an Sbh1-dependent substrate, Gls1. In the present work I characterized the sbh1 mutant strains. I also identified targeting signals that are Sbh1-dependent, Phospho-Sbh1 dependent, or Ess1-dependent. In a high content microscopic screen, I identified about 12% of secretory proteins assayed as Sbh1-dependent and I found that Sbh1-dependent proteins have suboptimal ER targeting sequences, with lower hydrophobicity and frequently without or with an inverse charge bias. A smaller fraction of proteins was dependent on N-terminal phosphorylation of Sbh1. I also developed and optimized different screens for finding the kinase responsible for S3/T5-Sbh1 phosphorylation, with no conclusive result. I conclude that Sbh1 promotes ER import of substrates with suboptimal targeting sequences and its activity can be regulated by a conformational change induced by N-terminal phosphorylation and I suggested a model for ER protein translocation regulation.

Die ER-Protein-Translokationskanal-Untereinheit Sbh1 ist nicht essentiell, enthält aber mehrere Phosphorylierungsstellen, was auf eine regulatorische Rolle beim ER-Proteinimport hindeutet. Es wurde bereits gezeigt, dass die Mutation von zwei N-terminalen, Prolin-flankierten Phosphorylierungsstellen in der zytosolischen Sbh1-Domäne die Temperaturempfindlichkeit eines Hefestamms, dem SBH1/SBH2 fehlt, phänokopiert und zu einer verringerten Translokation in das ER eines Sbh1-Abhängigen führt Substrat, Gls1. In der vorliegenden Arbeit habe ich die sbh1-Mutantenstämme charakterisiert. Ich habe auch Targeting-Signale identifiziert, die Sbh1-abhängig, Phospho-Sbh1-abhängig oder Ess1-abhängig sind. In einem mikroskopischen High-Content-Screen identifizierte ich etwa 12 % der sekretorischen Proteine, die als Sbh1-abhängig getestet wurden, und ich fand heraus, dass Sbh1-abhängige Proteine suboptimale ER-Targeting-Sequenzen mit geringerer Hydrophobizität und häufig ohne oder mit einer inversen Ladungsverzerrung aufweisen. Ein kleinerer Teil der Proteine war von der N-terminalen Phosphorylierung von Sbh1 abhängig. Ich habe auch verschiedene Screens entwickelt und optimiert, um die für die S3/T5-Sbh1-Phosphorylierung verantwortliche Kinase zu finden, ohne schlüssiges Ergebnis. Ich schlussfolgere, dass Sbh1 den ER-Import von Substraten mit suboptimalen Targeting-Sequenzen fördert und seine Aktivität durch eine durch N-terminale Phosphorylierung induzierte Konformationsänderung reguliert werden kann, und ich schlug ein Modell für die Regulation der ER-Proteintranslokation vor.