Development of novel genetically encoded fluorescent sensors for real-time monitoring of subcellular NADPH/NADP+ dynamics in living cells

Abstract

The essential and ubiquitous NADH/NAD+ and NADPH/NADP+ redox couples are central for cellular metabolism. NADPH is also the ultimate source of reductive power for the thiol-based antioxidant systems. Our current picture of NAD(P) redox metabolism is incomplete, in part due to the limitations of former measurement methods. The development of genetically encoded fluorescent sensors now permits the specific monitoring of changes in the NADH/NAD+ ratio and in NADPH concentration in living cells in defined subcellular compartments. Here, the pH-resistant NADH/NAD+ probe, Peredox, was used as a scaffold to develop novel NADPH/NADP+ ratio sensors. By rational mutagenesis of the NAD binding site, a series of NADPH/NADP+ sensors with a broad spectrum of NADPH binding affinities was generated, termed NAPstar probes. The characterization of these sensors in Saccharomyces cerevisiae cells demonstrated their specificity for NADPH/NADP+ changes, pH resistance, and high brightness relative to other genetically encoded NADH/NAD+ and NADPH probes. The application of the NAPstar sensors in yeast demonstrated an extreme robustness of the cytosolic NAPDH pool against oxidative perturbation. Furthermore, NADPH/NADP+ monitoring to assess the relative electron fluxes through the thioredoxin and glutathione/glutaredoxin pathways revealed a surprising importance for glutathione reductase compared to the thioredoxin system under pro-oxidative conditions.AJ

Die essentiellen, ubiquitären Redoxpaare NADH/NAD+ und NADPH/NADP+ sind von zentraler Bedeutung für den Zellmetabolismus. NADPH stellt ferner die Reduktionskraft für die Thiol-basierten antioxidativen Systeme bereit. Unser aktuelles Wissen über den NAD(P)-Redoxmetabolismus ist unvollständig, was zum Teil auf Limitierungen früherer Messmethoden zurückzuführen ist. Die Entwicklung von genetisch kodierten Fluoreszenzsensoren ermöglicht nun die gezielte Messung von Veränderungen des NADH/NAD+-Verhältnisses und der NADPH-Konzentration in lebenden Zellen in definierten Zellkompartimenten. Auf Grundlage des pH-resistenten NADH/NAD+-Sensors Peredox wurden neue Sensoren für das NADPH/NADP+-Verhältnis entwickelt. Durch gezielte Mutagenese der NAD-Bindungsstelle wurde eine Reihe von NADPH/NADP+-Sensoren mit unterschiedlichen NADPH-Affinitäten erzeugt, die NAPstar Sensoren. Die Charakterisierung dieser Sensoren in Saccharomyces cerevisiae zeigte ihre Spezifität für NADPH/NADP+, ihre pH-Beständigkeit und ihr starkes Fluoreszenzsignal im Vergleich zu anderen NADH/NAD+- und NADPH-Sonden. Die Anwendung der NAPstar-Sensoren in Hefe offenbarte eine starke Robustheit des zytosolischen NAPDH-Pools gegenüber oxidativen Störungen. Zudem enthüllte das NADPH/NADP+-Verhältnis zur Beurteilung der relativen Elektronenflüsse durch das Thioredoxin- und das Glutathion/Glutaredoxinsystem eine überraschende Relevanz der Glutathionreduktase im Vergleich zum Thioredoxinsystem unter prooxidativen Bedingungen.